三七總皂苷抑制胃癌進程的體外研究

石維娜 郝 杰 石新濤 (河北省中醫院脾胃病三科,石家莊 050011)

胃癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，且發病率有逐年增加的趨勢[1]，其致死率高[2]，目前胃癌的治療以手術切除為主要手段，但因早期胃癌無明顯癥狀，患者忍受性高，我國胃鏡普查推廣率低等導致很多胃癌患者發現時已處于晚期轉移階段，手術切除率低，化療也是胃癌的重要治療手段，但因化療副作用較大，導致效果不佳，5年生存率較低[3]。對于晚期轉移性胃癌患者而言，由于失去了最佳的手術機會，一般常規給予化療治療，但隨著治療周期的增加，患者也逐漸出現耐藥的情況[4]，不良反應增加，如骨髓抑制等[5],化療藥物也可以對患者的機體免疫功能造成損害，使得患者的治療依從性和治療效果因此受到限制[6]。故而，尋找新的有效且安全的藥物成為治療晚期胃癌的一大挑戰。

而我國作為中醫的起源地，有著龐大的中藥儲存及史料記載，其中很多中藥就被報道有抗腫瘤的特性，其中，三七便是一種。三七的主要成分是三七總皂苷，其抗腫瘤作用在多種類型的腫瘤中已被報道。如鄭文球等[7]報道了三七皂苷R1可以誘導白血病細胞系HL-60發生凋亡而起到抗腫瘤作用；柴瑞華等[8]報道了三七總皂苷對S180腫瘤細胞的增殖抑制作用和延長艾氏腹水癌小鼠生存期的影響；吳映雅等[9]則提出三七總皂苷對大鼠肝癌細胞的增殖抑制作用。但對于三七在胃癌中的作用研究卻鮮有報道，基于此，本研究旨在探索三七總皂苷是否可以抑制胃癌細胞系的體外生物學行為及其可能涉及的機制，為臨床上治療胃癌提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1材料 細胞培養基1640購自美國Coring公司(批號10-040-CVR)；氨芐青霉素、鏈霉素購自北京聚合美生物技術公司；Matrigel 基質膠購自美國康寧公司(貨號BD,356234)；胎牛血清購自 Gibco 公司(貨號10099-141)；細胞用培養皿、培養瓶、培養板、各種型號的槍頭、移液槍、Transwell小室、共聚焦小皿等常用耗材均購自北京普京康利有限公司；甲醇、多聚甲醛電泳液、電轉液、TBST等化學試劑均購自北京通廣試劑公司；相關指標抗體Vemintin(貨號D21H3)、SNAIL(貨號C15D3)、MMP2(貨號D4M2N)、MMP9(貨號D6O3H)、P21(貨號12D1)、Caspase-3(貨號D3R6Y)、BAX(貨號D2E11)和β-catenin(貨號D10A8)均購自美國CST公司；凋亡試劑盒、ECLPls化學發光試劑盒、HRP辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗及HRP辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG二抗均購自上海碧云天生物技術公司；PVDF(IPVH00010)轉印膜購自密理博(Millipore)公司，iFluor 594羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗購自PTG生物有限公司；核漿蛋白分離提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、Triton×100購自普利萊有限公司；電泳槽、配膠架及電轉槽等Western blot耗材均購自北京天能有限公司；三七總皂苷粉末購自西安飛達有限公司；FzM1.8購自MCE公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 實驗用的人胃癌細胞系：SGC-790、BGC-823及MKN-4均購自北京協和細胞庫，培養體系為含 10%FBS (Gibco,USA)+1% 雙抗RPMI-1640(Coring,USA)，在5%CO2的37℃孵箱環境中培養。

1.2.2細胞增殖實驗 采用經典的CCK8方法檢測三七總皂苷對人胃癌細胞系增殖能力的影響。首先將人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4按照倍比稀釋的方法在96孔板中以3 000個細胞/孔進行鋪板后，將細胞置于培養箱內6 h，待細胞貼壁完全后，棄去舊培養基，更換含200 mg/L[10]的三七總皂苷新鮮培養基，并于換液后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h對孔內細胞的OD值進行測量，測量時依據CCK8試劑盒說明書，每孔更換無血清培養基100 μl 后添加10 μl CCK8試劑，在細胞培養箱中孵育2 h后于酶標儀中進行檢測，記錄數值并計算。

1.2.3細胞劃痕修復試驗 將合適密度的人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4鋪于6孔細胞培養板中，使其密度至70%～80%，放入細胞培養箱中培養24 h后取出，用100 μl的槍頭在培養板中劃線，縱穿整個培養板，隨后用PBS將滑落的細胞洗去，后用含200 mg/L的三七總皂苷無血清新鮮培養基將細胞進行培養，48 h后取出細胞培養板，PBS洗去懸浮的細胞后，用多聚甲醛固定15 min，并于倒置顯微鏡下觀察拍照，以供后續分析。

1.2.4細胞侵襲試驗 做實驗之前提前將基質膠置于4℃冰箱中過夜解凍化開，并用無血清培養基按照1∶8的比例進行稀釋，隨后將稀釋的基質膠取150 μl均勻鋪于小室上室中，使其覆蓋上室，隨后將小室放入培養箱內約4 h使其凝固。同時，將人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4消化下來并用含200 mg/L的三七總皂苷無血清新鮮培養基將細胞密度調整為3×105個/ml，取100 μl接種于Transwell上室，下室加入10%FBS的培養基500 μl，注意此過程中避免產生氣泡，然后將小室放入培養箱中進行培養，48 h后取出小室，用PBS輕柔清洗上室2～3次，用棉棒在上室內輕輕轉動，以達到除去上室內未穿膜細胞的目的，隨后將穿膜的細胞用95%的乙醇室溫固定10～15 min，并用0.3%的結晶紫溶液進行細胞染色15 min，PBS清洗2～3次后，風干后置于倒置顯微鏡下拍照采圖，隨機選取5個視野，進行細胞計數后取平均值。

1.2.5免疫印跡試驗 Vemintin、SNAIL、MMP2、MMP9、P21、Caspase-3、BAX和β-catenin等蛋白的表達水平采用Western blot進行檢測。細胞在含三七總皂苷的培養基中培養48 h或者用三七總皂苷的培養基培養48 h并加入FzM1.8(2 μm，15 min)[11]后，用RIPA buffer(含蛋白酶抑制劑)裂解液收集細胞的蛋白樣品，其中檢測β-catenin的樣品組按照核漿蛋白分離提取試劑盒的產品說明書進行提取，并進一步用牛血清蛋白(BCA)試劑盒對所提取的蛋白質樣品的濃度進行測定。其余的蛋白樣品用Loading buffer煮沸后保存于-80℃冰箱，用于后續的凝膠電泳實驗。進行凝膠電泳時，各組分別取30 μg蛋白總量進行SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，隨后經電轉操作將蛋白轉移至PVDF膜上，進一步進行常溫封閉2 h，一抗4℃過夜孵育，二抗常溫孵育2 h后，根據ECL化學發光試劑盒說明書對PVDF膜上的蛋白印跡進行曝光顯色，并保存圖片，用Image J 進行灰度分析。

1.2.6細胞免疫熒光 提前將人胃癌細胞系SGC-790鋪于共聚焦小皿中，使其細胞密度約為70%～80%，置于培養箱中6 h待其貼壁完全之后，將培養基換成含三七總皂苷的培養基，并繼續培養24 h之后，用多聚甲醛將細胞進行固定15 min，PBS浸洗小皿3次，每次5 min，隨后用0.5%Triton室溫孵育15 min 進行通透，PBS浸洗3次，每次5 min，用山羊血清室溫封閉2 h，PBS浸洗3次，每次5 min，一抗β-catenin(1∶100)過夜孵育，二抗常溫孵育2 h，DAPI常溫孵育15 min后PBS清洗3次，每次 5 min，并置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1三七總皂苷可以抑制人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的增殖能力 由圖1可見，人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的增殖能力在三七總皂苷處理之后顯著降低(P<0.05)。

2.2三七總皂苷可以抑制人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的遷移能力 由圖2可見，人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的遷移能力在三七總皂苷處理之后顯著降低(P<0.05)。

2.3三七總皂苷可以抑制人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的侵襲能力 由圖3可見，人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的侵襲能力在三七總皂苷處理之后顯著降低(P<0.05)。

2.4三七總皂苷可以誘導人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的凋亡 由圖4可見，人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的凋亡水平在三七總皂苷處理之后顯著增加(P<0.05)。

圖1 人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經三七總皂苷處理之后的增殖能力變化

圖2 人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經三七總皂苷處理之后的遷移能力變化

圖3 人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經三七總皂苷處理之后的侵襲能力變化

圖4 人胃癌細胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經三七總皂苷處理之后的凋亡水平變化

2.5三七總皂苷可以下調人胃癌細胞系SGC-790中轉移、侵襲相關蛋白的表達，并上調周期阻滯蛋白和凋亡相關蛋白的表達 由圖5可見，人胃癌細胞系SGC-790經三七總皂苷處理之后MMP2、MMP9、Vemintin、SNAIL蛋白水平顯著減少，P21、BAX、Caspase-3蛋白水平顯著增加(P<0.05)。

圖5 人胃癌細胞系SGC-790經三七總皂苷處理之后相關蛋白的表達水平變化

圖6 三七總皂苷抑制SGC-790細胞中的Wnt/β-catenin通路活性

2.6三七總皂苷可以抑制人胃癌細胞系SGC-790中WNT/β-catenin通路活性 由圖6可見，人胃癌細胞系SGC-790經三七總皂苷處理之后，細胞核內β-catenin蛋白水平減少，其細胞空間定位發生改變，β-catenin核內定位減少(P<0.05)。

3 討論

三七總皂苷是五加科植物三七根莖中提取的主要有效成分，其藥用廣泛，具有諸多作用，如活血化瘀[12]，減緩氧化[13]，提高機體免疫功能[14]等。三七總皂苷可通過多種途徑發揮抗腫瘤的作用也屢見報道。尚西亮等[15]觀察到三七總皂苷可以通過誘導肝癌細胞發生凋亡而起到抑制肝癌進展的作用，程馥艷等[16]發現三七總皂苷可以通過增加IL-18及TNF-α而對HepG2移植瘤起到抑制作用；孫晶[17]報道了三七總皂苷可以誘導肝癌細胞發生S期阻滯而起到抑制增殖的作用；阮越勇等[18]報道了三七總皂苷通過對肺癌A549細胞上皮間質轉化的抑制作用而起到抑癌作用[18]?？梢?，三七總皂苷可以通過多種機制參與腫瘤的進程調控，而作為一種性溫的中藥成分，三七總皂苷與化療藥物或放療的聯用也逐漸受到臨床醫生的重視，可以增加療效，減少副作用，如吳珊珊等[19]發現三七總皂苷能顯著協同增加三苯氧胺抗乳腺癌的作用,其機制可能與調控mTOR信號通路,逆轉三苯氧胺耐藥有關；張瑋等[20]發現三七總皂苷聯合X線可顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖、遷移能力,增加肝癌細胞的凋亡;張瑋等[21]發現三七總皂苷聯合順鉑可顯著抑制肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的增殖,且能顯著降低肝癌細胞遷移和侵襲的能力,增加肝癌細胞的凋亡。這些證據都提示，三七總皂苷具有巨大的臨床應用潛力，可以從多個方面起到抑癌作用。

胃癌具有高度侵襲性，其發病率及死亡率高，目前其發病及進展機制仍處于艱難的探索階段[22]。而WNT通路除了與胚胎發育調控有著密切關系之外，其與腫瘤的進程也存在顯著的相關性[23]，參與多種腫瘤的調控。WNT通路在胃癌中存在異常激活狀態，其可以對胃癌細胞的增殖、分化、侵襲等腫瘤學行為發揮調控作用。Huang等[24]提出WNT通路的激活可以使得胃癌細胞系發生上皮間質轉化，從而促進胃癌的轉移侵襲等進程；Weng等[25]提出WNT通路失活后，胃癌細胞系的增殖、轉移和侵襲能力也隨之下降，而黏附能力增加，胃癌進程得以抑制；張華等[26]、肖登峰等[27]提出WNT/β-catenin通路與胃癌分化及轉移之間存在著顯著的臨床相關性。

我們的研究發現，三七總皂苷可以抑制胃癌細胞系體外的生物學行為，包括增殖、轉移和侵襲等，不僅在細胞表型功能上起到明顯的抑制作用，而且在蛋白水平上也得到了相應的驗證，如MMP2、MMP9、Vemintin、SNAIL等蛋白水平的減少可以提示，三七總皂苷確實抑制胃癌細胞系的轉移和侵襲能力，且三七總皂苷可以增加P21的表達，意味著其可以誘導胃癌細胞系發生G1/S周期阻滯，這與增殖能力受阻的表型相一致。此外，我們還發現，三七總皂苷可以誘導胃癌細胞系發生凋亡，不僅細胞凋亡比例增高，其凋亡相關蛋白Caspase-3及BAX表達水平也有顯著提高。在機制上，我們發現，三七總皂苷可以使β-catenin的細胞核內分布減少，細胞核內蛋白水平減少，且Wnt激活劑可以逆轉這種趨勢，這提示，三七總皂苷可以通過抑制WNT/β-catenin通路起到抑制胃癌細胞系增殖、轉移和侵襲的能力，并誘導胃癌細胞系發生凋亡，這為臨床上應用三七總皂苷治療胃癌提供了理論基礎。