芪參益氣滴丸治療射血分數保留心力衰竭的網絡藥理學研究

張 杰 賴潤民 鞠建慶 陳 卓 徐 浩▲

1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中國中醫科學院西苑醫院心血管科，北京 100091；3.中國中醫科學院西苑醫院血液科，北京 100091

左心室射血分數保留心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）占臨床診斷心力衰竭患者的22%～73%[1]，其死亡率與射血分數降低心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）相似[2]，且目前證據顯示尚無降低HFpEF 患者發病率或死亡率的有效方法[3]。中醫氣血理論認為與HFrEF 陽虛不得溫化水飲不同，HFpEF 的病機為氣虛血瘀終致水停，治療應以益氣活血為法[4]。課題組前期薈萃分析證實[5]益氣活血法有助于改善HFpEF 患者心功能、E/A 比值及6 min 步行距離。芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香組成，是益氣活血的代表方藥，多項臨床試驗顯示[6-7]芪參益氣滴丸治療HFpEF 具有良好效果。然而，中藥復方化學成分復雜、作用機制多樣，芪參益氣滴丸治療HFpEF 的物質基礎和作用機制尚不清晰。因此，利用網絡藥理學方法闡釋芪參益氣滴丸治療HFpEF 的潛在活性成分和作用機制，對于開展深入的基礎研究和拓展臨床思路均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 芪參益氣滴丸活性成分與潛在靶點篩選

利用BATMAN-TCM 平臺（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）篩選黃芪、丹參、三七和降香的活性成分及潛在靶點基因。檢索參數設置為Score cutoff≥20，P-value cutoff＜0.05，建立活性成分-靶點基因數據庫。

1.2 射血分數保留心力衰竭的疾病靶點篩選

利用GeneCards（http：//www.genecards.org/）和PALM-IST 平臺（http：//www.hpppi.iicb.res.in/ctm/）篩選HFpEF 的疾病靶點基因，以“heart failure with preserved ejection fraction”為關鍵詞進行檢索。

1.3 “藥物-活性成分-作用靶點”網絡構建與分析

利用Cytoscape 3.2.1 軟件構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡并進行可視化，利用network analyzer插件進行網絡拓撲結構分析，將自由度≥10 的靶基因導入STRING 數據庫（https：//string-db.org/）進行基因相互作用分析。

1.4 基因富集分析

將芪參益氣滴丸治療HFpEF 的靶基因導入Metascape數據庫（http：//metascape.org）進行基因富集分析。以P ＜0.01 為差異有統計學意義的篩選條件，設置min overlap=3，min enrichment=1.5，對獲取的靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析及可視化。

2 結果

2.1 芪參益氣滴丸治療HFpEF 的活性成分和潛在靶點

經BATMAN-TCM 平臺檢索，共獲得芪參益氣滴丸化學成分112 個，經GeneCards 和PALM-IST 平臺檢索，共獲得人類HFpEF 疾病靶點基因804 個，取芪參益氣滴丸靶點基因和HFpEF 疾病靶點基因交集，共獲得芪參益氣滴丸治療HFpEF 的潛在靶點基因262 個，具有治療HFpEF 作用的活性成分95 個，其中靶基因數目在20 以上的主要活性成分26 個。見表1。

表1 芪參益氣滴丸治療射血分數保留心衰的主要活性成分

2.2 “藥物-活性成分-作用靶點”網絡及靶點互作分析結果

利用Cytoscape 3.2.1 構建芪參益氣滴丸治療HFpEF 的“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖，該網絡圖共包含361 個節點（4 個藥物，95 個成分靶點，262 個基因靶點），1362 條邊，深綠色六邊形節點代表藥物，淺綠色矩形節點代表活性成分，黃色圓形節點代表作用靶點。見圖1（封四）。用network analyzer 插件進行網絡拓撲結構分析，自由度≥10 的39 個重要靶點基因相互作用關系。見圖2。

2.3 GO 富集分析

圖2 自由度≥10 的39 個重要靶點基因相互作用網絡圖

GO 富集分析結果顯示，芪參益氣滴丸治療HFpEF的生物學過程主要包括血液循環、循環系統過程、系統過程的調控、循環系統的血管過程、血管口徑的調節等；細胞成分主要包括膜筏、膜微區、膜區等；分子功能主要包括受體-配體活性、受體調節活性、細胞因子活性等，涉及細胞信號轉導、免疫反應等。見圖3（封四）。

2.4 信號通路富集分析

KEGG 信號通路富集靶點數量前20 的信號通路涉及氧化應激、炎性反應、心肌纖維化和細胞凋亡等與HFpEF 密切相關的病理生理學過程。見圖4（封四）。

3 討論

HFpEF 是一種復雜的臨床綜合征，其病理生理學機制尚不明確，涉及全身微血管炎癥、氧化應激、心肌纖維化、上皮功能受損、神經激素激活和心室-動脈耦合等多個病理環節[8-9]。HFpEF 目前尚無理想的藥物治療方法，如何早期干預HFpEF 成為臨床亟待解決的難題。中醫學理論認為氣虛血瘀是HFpEF 的關鍵病機，益氣活血作用的中醫藥具有較好的緩解HFpEF 患者癥狀和改善心臟舒張功能的作用，展現出良好的臨床應用價值。

芪參益氣滴丸是益氣活血的代表方藥，既往研究顯示芪參益氣滴丸具有抗炎[10]、抗心肌細胞凋亡、延緩心室重構等作用[11-14]。本研究亦發現芪參益氣滴丸中黃芪、丹參、三七的20 余種主要活性成分可通過調控多個基因發揮治療作用。如丹參的有效成分丹參新酮具有抗氧化應激的作用，其誘導的核因子Nrf2 和血紅素加氧酶-1 表達與MAPK 途徑有關，通過HO-1和MAPK/Nrf2 依賴途徑保護人EA.hy926 內皮細胞免受氧化低密度脂蛋白衍生的氧化應激損傷[15]；黃芪的有效成分刀豆氨酸是誘導型一氧化氮合酶的選擇性抑制劑[16]，具有抑制炎性反應和氧化應激的作用。

GO 生物學過程富集分析結果顯示芪參益氣滴丸可通過調節循環系統、神經調節、氧化應激、免疫應答、激素調節等多個生物過程發揮治療HFpEF 的作用，這與HFpEF 發病機制復雜、涉及多個病理環節的疾病特點相吻合[3,8]。

KEGG 富集分析結果顯示芪參益氣滴丸治療HFpEF 相關通路涉及炎性反應、氧化應激、心肌纖維化、細胞凋亡等多種病理生理學過程。炎癥在HFpEF的發病中扮演著重要角色[17]，Paulus 等[18]提出HFpEF發病機制的新理論，即合并癥誘導全身性炎癥狀態、冠狀動脈微血管內皮炎癥、cGMP 含量和蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）活性降低，導致心肌順應性降低、心室肥大，將對HFpEF 病理機制的認識從左心室后負荷轉移到冠狀動脈微血管炎癥。推測芪參益氣滴丸既可作用于TNF 信號通路、IL-17 信號通路等炎癥相關途徑直接抑制炎性反應，又能作用于MAPK 信號通路等氧化應激途徑間接抑制炎性反應；此外，氧供需失衡在CHF 中普遍存在，HIF-1α 在組織對缺氧的反應中發揮關鍵作用，能夠調節心肌細胞氧供平衡，降低炎性反應，減輕心肌纖維化[19]。HFpEF 的發病與高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等密切相關[20-21]，上述合并癥可導致全身炎性反應及血管內皮細胞氧化應激[16]，大約45%的HFpEF 患者有糖尿病[22]，芪參益氣滴丸可作用于糖尿病中的AGE-RAGE 信號通路，降低高糖環境所致的氧化應激和炎性反應。同時，芪參益氣滴丸通過鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路等改善心肌順應性及僵硬度，減輕心肌重構。cGMP-PKG信號通路是HFpEF 機制的研究熱點，cGMP 信號傳導與心肌舒張功能障礙和心室重構有關：促炎狀態下，血漿中IL-6、TNF-α、可溶性ST2 和五聚蛋白3 升高，冠狀微血管內皮細胞反應性產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecules，VCAMs）和E-選擇蛋白，ROS 的產生導致一氧化氮生物利用度降低，可溶性鳥苷酸環化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）和PKG活性降低，低PKG 活性增加了心肌細胞的靜息張力；內皮細胞中的VCAM 和E-選擇蛋白表達遷移到單核細胞內皮下，釋放轉化生長因子β，刺激成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，使心肌順應性降低，舒張功能障礙[23]。此外，芪參益氣滴丸通過TNF 信號通路等抑制細胞凋亡，亦是其治療HFpEF 的重要機制之一。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法對芪參益氣滴丸治療HFpEF 的活性成分、作用靶點和信號通路進行了探索性研究，初步發現芪參益氣滴丸中的主要活性成分可通過調控炎性反應和氧化應激、改善心肌順應性和調控細胞凋亡等途徑發揮治療HFpEF 的作用，具有多成分、多靶點、多途徑整合調節的效應特點，為進一步深入開展芪參益氣滴丸治療HFpEF 的作用機制研究提供了新的思路和線索。