黑木耳黑枸杞復合飲料研制及其體外抗氧化性

秦丹丹，曹慧馨，白洋，趙爽，吳瓊

（長春大學食品科學與工程學院，吉林長春130022）

黑木耳（Auricularia auricular）是我國傳統的食藥兼用菌，營養豐富，含有多糖、蛋白質、維生素、脂肪和鈣、磷、鐵等元素，其具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗衰老、增強免疫力等功能[1-7]。

黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬，含有豐富的脂肪、氨基酸、花青素、VC和大量有益人體的微量元素等，兼具保健作用和藥用價值[8]。研究表明，黑枸杞具有抗氧化、益精明目、抗衰老、降低膽固醇的作用，同時對治療心臟病、月經不調等藥效顯著[9-14]。

鑒于黑木耳、黑枸杞的保健療效，本研究以黑木耳、黑枸杞為原料，輔以檸檬酸、蜂蜜、羧甲基纖維素鈉、果膠與黃原膠，研制一款營養豐富黑木耳黑枸杞復合飲料。試驗為黑木耳、黑枸杞等天然資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳、黑枸杞干果及蜂蜜：吉林省長春市沃爾瑪超市。

纖維素酶：美國sigma 公司；果膠、磷酸氫二鈉、黃原膠、檸檬酸、維生素C、羧甲基纖維素鈉等添加劑（食品級）：市售。水楊酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，THAM]（分析純）：大連美侖生物技術有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；硫酸亞鐵、鹽酸、過氧化氫（分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器及設備

UV-2700 型紫外可見分光光度計、AUW120 型電子天平：日本島津儀器有限責任公司；GZX-9070MBE型電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；WJX-A1000 型高速多功能粉碎機：上海緣沃工貿有限公司；HH-ZK1 型恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-3C 型pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；NTS-4000B 型恒溫震蕩水槽：日本東京理化器械株式會社；TDL-50B 型低速離心機：上海安亭科學儀器廠；YJGY-100 型高壓均質機：天津特斯達食品機械科技有限公司；ATS-06 型打漿機：浙江榮浩工貿有限公司；JIL-80 型膠體磨：溫州市長宏輕工機械有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 工藝要點

1.4.1 黑木耳汁制備

1）浸提：稱量烘干粉碎過的黑木耳粉末，加入30倍體積的蒸餾水，在80 ℃下浸提2 h，重復2 次，離心（4 800 r/min）20 min，保存上清液。

2）酶處理：將浸提液用磷酸緩沖液調pH 值至4.0，加入13 500 U/g 的纖維素酶，置于51 ℃恒溫振蕩水槽中反應3 h。然后放入沸水中反應10 min 滅活纖維素酶，離心（4 800 r/min）20 min，上清液為黑木耳汁。

1.4.2 黑枸杞汁制備

稱取清洗過的黑枸杞干果，料液比 1 ∶10（g/mL），在70 ℃的溫度下浸提30 min，打漿后再次浸提30 min，過濾得到黑枸杞汁。

1.4.3 調配

黑木耳汁、黑枸杞汁、蜂蜜、檸檬酸以一定比例在水中混合成原料液后，加入復合穩定劑（羧甲基纖維素鈉、果膠與黃原膠按一定配比制得的溶液），調配至成品。

1.4.4 均質

將調配研磨好的料液在20 MPa 壓力下進行均質。

1.4.5 灌裝與滅菌

將料液加熱到95 ℃進行熱灌裝，然后在100 ℃水中加熱殺菌15 min，冷卻后制得黑木耳黑枸杞復合飲料。

1.5 原料液配比設置

1.5.1 單因素試驗設計

固定黑枸杞汁用量20%、檸檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6%，考察黑木耳汁用量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）對復合飲料感官評價的影響；固定黑木耳汁用量20%、檸檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6%，考察黑枸杞汁用量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）對復合飲料感官評價的影響；固定黑木耳汁用量20%、黑枸杞汁用量20%、蜂蜜用量6%，考察檸檬酸用量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）對復合飲料感官評價的影響；固定黑木耳汁用量20%、黑枸杞汁用量20%、檸檬酸用量0.20%，考察蜂蜜用量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）對復合飲料感官評價的影響。

1.5.2 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，以黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、檸檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D）為響應因素，以感官評分（Y）為響應值，采用Design Expert 8.0.6軟件，根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，進行四因素三水平響應面試驗，確定復合飲料的最佳配方。試驗設計因素與水平見表1。

1.5.3 感官評價測定

由10 名經過食品感官技能培訓的教師組成評定小組，根據GB/T 31326-2014《植物飲料》對黑木耳黑枸杞復合飲料給予評價。感官評價標準見表2。

表1 Box-Benhnken 試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken experimental design

表2 復合飲料感官評價表Table 2 Sensory evaluation of compound beverage

1.6 復合穩定劑配比設計

1.6.1 單因素試驗設計

向飲料中只添加一種穩定劑不利于其穩定性。為了避免黑木耳黑枸杞復合飲料發生沉淀的現象，向其中加入復配的穩定劑來增強穩定性。

固定果膠用量0.07%、黃原膠用量0.04 %，考察羧甲基纖維素鈉用量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）對復合飲料離心沉淀率的影響；固定羧甲基纖維素鈉用量0.08%、黃原膠用量0.04%，考察果膠用量（0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.11%）對復合飲料離心沉淀率的影響；固定羧甲基纖維素鈉用量0.08%、果膠用量0.07%，考察黃原膠用量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）對復合飲料離心沉淀率的影響。在上述單因素試驗中，固定原料液配比為在黑木耳汁20%、黑枸杞汁20%、檸檬酸0.20%條件下，蜂蜜6%。

1.6.2 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，以羧甲基纖維素鈉用量（A）、果膠用量（B）、黃原膠用量（C）為響應因素，以離心沉淀率（Y）為響應值，采用Design Expert 8.0.6 軟件，根據Box-Benhnken 中心組合設計原理進行試驗，確定復合穩定劑的最佳復配比。試驗設計因素與水平見表3。

表3 Box-Benhnken 試驗設計因素與水平Table 3 Factors and levels in Box-Benhnken experimental design

1.6.3 離心沉淀率測定

離心沉淀率能反映出溶液的穩定性。離心沉淀率越大，則溶液穩定性越差[15]。將黑木耳黑枸杞飲料攪拌均勻，稱取一定質量m1（g），4 000 r/min 離心15 min后，稱取沉淀質量m2（g）。按下式計算離心沉淀率：

1.6.4 貯藏穩定性研究

將經過灌裝滅菌的產品分別在37 ℃恒溫培養箱和4 ℃冰箱存放6 個月，觀察有無明顯沉淀與分層。

1.7 復合飲料抗氧化性試驗

1.7.1 DPPH 自由基清除能力測定

向15 mL 的離心管中加入2 mL 復合飲料和2 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），渦旋振蕩搖勻，在 37 ℃下避光保存30 min。以無水乙醇為參比，以維生素C作為陽性對照，在517 nm 處測定吸光度值，每個試驗平行3 次[16]。清除率按下式計算：

式中：A0為2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL 無水乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL 復合飲料的吸光度；A2為2 mL 無水乙醇+2 mL 復合飲料的吸光度。

1.7.2 羥自由基清除能力測定

向15 mL 的離心管中加入2 mL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）、2 mL 過氧化氫溶液（6 mmol/L）、2 mL 水楊酸溶液（6 mmol/L）和 2 mL 復合飲料，在 37 ℃條件下反應1 h。以蒸餾水為參比，以維生素C 作為陽性對照，在517 nm 波長處測定吸光度，每個試驗平行3 次[17]。清除率按下式計算：

式中：A0為2 mL 硫酸亞鐵溶液+2 mL 過氧化氫溶液+2 mL 水楊酸+2 mL 蒸餾水吸光度；A1為 2 mL 硫酸亞鐵溶液+2 mL 過氧化氫溶液+2 mL 水楊酸+2 mL 復合飲料吸光度；A2為2 mL 硫酸亞鐵溶液+2 mL 蒸餾水+2 mL 水楊酸+2 mL 復合飲料吸光度。

1.7.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

向15 mL 的離心管中加入4.5 mLTris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH 8.2）和 0.5 mL 復合飲料，搖勻，置于37 ℃條件下預熱20 min，然后加入0.5 mL 在37 ℃條件下預熱過的鄰苯三酚（3mmol/L）。以HCl（10mmol/L）溶液為參比，以維生素C 作為陽性對照，在325 nm 波長下測定吸光度，每個試驗平行3 次[18]。清除率按下式計算：

式中：A0為 4.5 mL Tris-HCl 緩沖液+0.5 mL 復合飲料+0.5 mL 鄰苯三酚溶液吸光度；A1為4.5 mL Tris-HCl 緩沖液+0.5 mL 復合飲料+0.5 mL 蒸餾水吸光度；A2為 4.5 mL Tris-HCl 緩沖液+0.5 mL 蒸餾水+0.5 mL鄰苯三酚溶液吸光度。

2 結果與討論

2.1 原料液配比

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 黑木耳汁用量的影響

黑木耳汁用量對復合飲料感官評價的影響見圖1。

由圖1 可知，當黑木耳汁用量為20%時，黑木耳黑枸杞復合飲料的感官評價得分最高，此時其口感適宜。當黑木耳汁濃度偏高時，掩蓋了其他成分味道，導致復合飲料口感變差。

2.1.1.2 黑枸杞汁用量的影響

黑枸杞汁用量對復合飲料感官評價的影響見圖2。

由圖2 可知，隨著黑枸杞用量的增大，黑木耳黑枸杞復合飲料的感官評價得分逐漸增大。當黑枸杞汁用量為20%時，其感官評價得分最高。黑枸杞汁濃度偏高時，飲料顏色過深，口感變差。

2.1.1.3 檸檬酸用量的影響

檸檬酸用量對復合飲料感官評價的影響見圖3。

圖3 檸檬酸用量對復合飲料感官評價的影響Fig.3 The effect of citric acid addition on sensory evaluation of compound beverage

由圖3 可知，檸檬酸用量為0.20%時，黑木耳黑枸杞復合飲料的感官評價得分最高。檸檬酸對復合飲料的風味口感有直接干擾，當檸檬酸用量較小時則甜味明顯，用量較大則酸味突出，導致飲料口感欠佳。

2.1.1.4 蜂蜜用量的影響

蜂蜜用量對復合飲料感官評價的影響見圖4。

圖4 蜂蜜用量對復合飲料感官評價的影響Fig.4 The effect of honey addition on sensory evaluation of compound beverage

由圖4 可知，蜂蜜用量為6%時，黑木耳黑枸杞復合飲料的感官評價得分最高。當蜂蜜用量較低時，飲料甜味偏淡，稍有苦澀味，而蜂蜜用量較高時，飲料甜味濃郁，會掩蔽原料獨有的味道，導致飲料口感欠佳。

2.1.2 響應面優化試驗

2.1.2.1 試驗結果

根據單因素試驗結果，利用響應面法優化黑木耳黑枸杞復合飲料的配方。根據響應面Box-Behnken 設計29 組試驗，其中5 組中心試驗進行試驗誤差估測，其余24 組用于分析因點。具體試驗設計及結果見表4。

表4 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 4 The design and results of Box-Behnken experments

采用Design-Expert 8.0.5 軟件對表4 數據進行二次多項式回歸分析，獲得感官評價（Y）對黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、檸檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D） 的二次多項回歸方程：Y=89.92-1.71A+0.57B-0.50C-2.54D+3.15AB-0.57AC+1.20AD-1.45BC-1.25BD+0.47CD-1.91A2-1.72B2-2.47C2-0.68D2。

對上述回歸方程進行方差分析，結果如表5 所示。

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表5 可知，該模型P＜0.000 1 表明二次回歸模型極顯著；決定系數R2為0.975 9，表示感官評價試驗值與模擬回歸值有很好的一致性。此外，R2Adj和R2的值非常接近，即證明有足夠大的樣本容量。另外，該模型的變異系數（C.V）為0.75%，說明了其高重復性，試驗值具有較高的精確度和良好的可靠性。精密度為25.304，遠大于4，說明該模型可以用來對試驗結果進行擬合。失擬項P=0.753 1＞0.05，即失擬項不顯著，表示此方程可以較好的描述各條件和感官評價的關系，所以可用此模型來分析和預測黑木耳汁用量、黑枸杞汁用量、檸檬酸用量、蜂蜜用量對黑木耳黑枸杞復合飲料感官評價的影響。

從四因素[黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、檸檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D）]對復合飲料感官評價（Y）的影響來分析：回歸方程的一次項A、B、D、二次項A2、B2、C2以及交互項 AB、AD、BC、BD 對感官評價的影響極顯著（P＜0.01），一次項 C 及二次項 D2對感官評價的影響顯著（P＜0.05），由此可見各因素對感官評價的響應不是簡單的線性關系。從F 值可以看出對復合飲料感官評價的影響因素排序為蜂蜜用量>黑木耳汁用量>黑枸杞汁用量>檸檬酸用量。

2.1.2.2 響應面分析

各因素交互作用對感官評價影響的響應面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對感官評價影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on sensory evaluation

圖5 反映了黑木耳汁用量（A）、黑枸杞汁用量（B）、檸檬酸用量（C）、蜂蜜用量（D）4 個因素之間的交互作用及對復合飲料感官評價的影響。響應面坡度越陡表明響應值對于處理條件的改變非常敏感，反之則影響不大[19]。等高線越近似橢圓形表明兩因素交互作用越強，反之，等高線越近似圓形表明兩因素交互作用越弱[20]。由方差分析及響應面可知，黑木耳汁用量和黑枸杞汁用量的交互作用最強，其次是黑枸杞汁用量和檸檬酸用量的交互作用，然后是黑枸杞用量和蜂蜜用量的交互作用，而黑木耳汁用量和蜂蜜用量的交互作用最弱。

2.1.2.3 驗證試驗

由軟件Design-Expert8.0.5 優化可得，黑木耳黑枸杞復合飲料中的最優配方為：黑木耳汁用量16.28%、黑枸杞汁用量17.87%、檸檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6.11%，理論感官評分為92.7 分。考慮到操作的方便性，將最佳配方用量調整為，黑木耳汁16%、黑枸杞汁18%、檸檬酸0.20%、蜂蜜6%。在此條件下做3 次重復試驗，得到感官評分為91.7 分，與預測值接近。

2.2 復合穩定劑配比

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 羧甲基纖維素鈉用量的影響

羧甲基纖維素鈉用量對離心沉淀率的影響見圖6。

圖6 羧甲基纖維素鈉用量對離心沉淀率的影響Fig.6 The effect of carboxymethyl cellulose sodium content on centrifugation sedimentation rate

由圖6 可知，羥甲基纖維素納用量在0.08%時，黑木耳黑枸杞復合飲料的離心沉淀率下降趨于穩定，說明此時體系趨于穩定。當其用量小于0.08%時，復合飲料離心沉淀率較大、穩定性較差，當其用量大于0.08%時，黑木耳黑枸杞復合飲料離心沉淀率較小、穩定性較好，但粘稠度較高，影響口感。

2.2.1.2 果膠用量的影響

果膠用量對離心沉淀率的影響見圖7。

圖7 果膠用量對離心沉淀率的影響Fig.7 The effect of pectin content on centrifugation sedimentation rate

由圖7 可知，果膠用量為0.07%時，黑木耳黑枸杞復合飲料的離心沉淀率下降趨于穩定。當果膠用量大于0.07%時，黑木耳黑枸杞復合飲料太過粘稠，影響口感。

2.2.1.3 黃原膠用量的影響

黃原膠用量對離心沉淀率的影響見圖8。

圖8 黃原膠用量對離心沉淀率的影響Fig.8 The effect of xanthan gum content on centrifugation sedimentation rate

由圖8 可知，黃原膠用量為0.04%時，黑木耳黑枸杞復合飲料的離心沉淀率下降趨于穩定。當用量大于0.04%時，黑木耳黑枸杞復合復合飲料離心沉淀率較小，說明其穩定性較好，但此時飲料過于黏稠，不利于口感。

2.2.2 響應面優化

2.2.2.1 試驗結果

根據單因素試驗結果，利用響應面法對復合穩定劑的復配比進行優化。根據響應面Box-Behnken 設計17 組試驗，其中5 組中心試驗進行試驗誤差估測，其余12 組用于分析因點。具體試驗設計及結果見表6。

采用Design-Expert 8.0.5 軟件對表6 數據進行二次多項式回歸分析，獲得離心沉淀率（Y）對羧甲基纖維素鈉用量（A）、果膠用量（B）、黃原膠用量（C）的二次多項回歸方程：Y=1.05-6.250×10-3A-0.045B-0.019C+0.027AB-0.035AC-2.500×10-3BC+0.068A2+0.10B2+0.11C2。對上述回歸方程進行方差分析，結果如表7 所示。

表6 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 6 The design and results of Box-Behnken experments

表7 回歸方程方差分析表Table 7 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表7 可知，該模型P＜0.000 1 表明二次回歸模型極顯著；決定系數R2為0.990 2，說明離心沉淀率的試驗值與模擬回歸值一致。此外，R2Adj和R2的值非常接近，即證明有足夠大的樣本容量。另外，該模型的變異系數（C.V）為1.26%，表示其高重復性，試驗值具有較高的精確度和良好的可靠性。精密度為24.123，遠大于4，說明該模型可以用來對試驗結果進行擬合。失擬項P=0.974 3＞0.05，即失擬項不顯著，說明該方程可以較好的描述各條件和離心沉淀率的關系，因此可用此模型來分析和預測羧甲基纖維素鈉用量、果膠用量、黃原膠用量對復合飲料離心沉淀率的影響。

從三因素[羧甲基纖維素鈉用量（A）、果膠用量（B）、黃原膠用量（C）]對復合飲料離心沉淀率（Y）的影響來分析：回歸方程的一次項B、C、二次項A2、B2、C2以及交互項AB、AC 對離心沉淀率的影響極顯著（P＜0.01），由此可見各因素對離心沉淀率的響應不是簡單的線性關系。從F 值可以看出對復合飲料離心沉淀率的影響因素排序為果膠用量＞黃原膠用量＞羧甲基纖維素鈉用量。

2.2.2.2 響應面分析

各因素交互作用對離心沉淀率影響的響應面圖見圖9。

圖9 各因素交互作用對離心沉淀率影響的響應面圖Fig.9 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on centrifugation sedimentation rate

圖9 反映了羧甲基纖維素鈉用量（A）、果膠用量（B）、黃原膠用量（C）3 個因素之間的交互作用及對黑木耳黑枸杞復合飲料離心沉淀率的影響。從圖9 可知，穩定劑有利于黑木耳黑枸杞復合飲料離心沉淀率的下降。由方差分析及響應面可以看出，羧甲基纖維素鈉用量和果膠用量的交互作用最強，其次是羧甲基纖維素鈉用量和黃原膠用量的交互作用，而果膠用量和黃原膠用量的交互作用最弱。

2.2.2.3 驗證試驗

由響應面法分析可得，飲料中復合穩定劑最佳配比參數為：羧甲基纖維素鈉用量0.08%、果膠用量0.07%、黃原膠用量0.04%，離心沉淀率最低預測值1.04%。按照上述配比，做3 次重復試驗，測得黑木耳黑枸杞復合飲料的實際離心沉淀率為1.05%，與預測結果相近。飲料放置6 個月后，無明顯沉淀與分層。

2.3 復合飲料抗氧化性試驗

通過測定黑木耳黑枸杞復合飲料和維生素C 對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，來檢測復合飲料的抗氧化活性，結果見如表8所示。

表8 復合飲料對3 種自由基的清除率Table 8 The scavenging rate of compound beverage against three kinds of oxygen radicals

從表8 可以看出，黑木耳黑枸杞復合飲料具有一定的抗氧化活性，其對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力分別達到59.20%、43.60%、67.45%。

3 結論

本文以黑木耳、黑枸杞為原料，以檸檬酸、蜂蜜、羧甲基纖維素鈉、果膠與黃原膠為輔料研制黑木耳黑枸杞復合飲料。通過單因素與響應面試驗確定黑木耳黑枸杞復合飲料中原料液最佳配比參數為：黑木耳汁用量16%、黑枸杞汁用量18%、檸檬酸用量0.20%、蜂蜜用量6%，感官評價達到91.7 分；通過單因素與響應面試驗確定黑木耳黑枸杞復合飲料中復合穩定劑的最佳配比參數為：羧甲基纖維素鈉用量0.08%、果膠用量0.07%、黃原膠用量0.04%，離心沉淀率為1.05%。根據上述最佳配比參數制得的復合飲料顏色呈紫紅色，具有黑木耳與黑枸杞特有的風味，酸甜適中，無明顯沉淀與分層。該復合飲料還具有較好的抗氧化活性，對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力達到59.20%、43.60%、67.45%，因而具有較好的推廣前景。