二氫槲皮素對異丙腎上腺素所致急性心肌缺血大鼠心肌磷脂酰肌醇3-激酶/糖原合成酶激酶-3β信號通路的影響

吳明娟 費洪新 田 明 周忠光 韓玉生

1.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江哈爾濱 150036；2.廣西科技大學基礎醫學部，廣西柳州 545005；3.黑龍江中醫藥大學中醫研究院，黑龍江哈爾濱 150040；4.黑龍江中醫藥大學實驗中心，黑龍江哈爾濱 150040

心血管疾病發病率近年來呈逐漸上升的趨勢，其中，急性心肌缺血的發病率不斷上升，其是影響全球生存率和死亡率的重要原因[1-2]。本研究通過腹腔注射異丙腎上腺素建立急性心肌缺血大鼠模型，以二氫槲皮素進行干預，觀察其對血液流變學、抗氧化指標和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信號通路影響，進一步探討二氫槲皮素在防治心肌缺血中的作用機制及可能的作用靶點，為臨床研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠60 只，8～10 周齡，體重（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（黑）2013-004。大鼠每籠6 只，自由飲水攝食，實驗室溫度為（23±2）℃，濕度55%～650%，光照與黑暗周期12 h，每3 天更換1 次墊料。適應性喂養適應1 周后開始實驗。

1.2 試劑

二氫槲皮素（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z07M6B）；異丙腎上腺素（美國Sigma 公司，批號：101443898）；地奧心血康（成都地奧集團，批號：2016 1024）；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程公司，批號：20170410、20170324、20170310、20170425、20170315、20170415）；兔抗PI3K、磷酸化蛋白激酶B、GSK-3β 抗體（美國Santa Cruz 公司，批號：sc-365290、sc-81434、sc-9166）；HRP 標記抗兔IgG 和鼠抗GAPDH 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；組織蛋白抽提試劑、BCA 蛋白定量試劑盒、化學發光試劑盒和PVDF 膜（碧云天生物技術研究所）。

1.3 儀器

LBY-N7500B 型全自動血液流變儀（北京普利生儀器有限公司）；CPA225D 型電子分析天平（賽多利公司，精密度1/100 g）；KDC-160R 型高速冰凍離心機（科大創新股份有限公司）；2235 型組織切片機（德國菜卡公司）；Nikon E600 型光學顯微鏡（日本Nikon）；UV-2401 型紫外分光光度計（日本島津公司）；Universal hood Ⅱ型凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組、給藥及造模 將60 只SD 大鼠按隨機數字表法分成空白組、模型組、地奧心血康組和二氫槲皮素高、中、低劑量組，每組10 只。二氫槲皮素用0.4%羧甲基纖維素鈉配制后，二氫槲皮素高、中、低劑量組大鼠給藥劑量分別為60、30 mg/kg 和15 mg/kg；地奧心血康組給藥劑量為54 mg/kg；空白組與模型組大鼠給予等體積羧甲基纖維素鈉，每日1 次，連續灌胃給藥14 d。第12 天開始，除空白組外，其余各組均腹腔注射異丙腎上腺素（ISO）5 mg/kg，1 次/d，連續3 d。

1.4.2 血液流變學檢測 各組大鼠用10%水合氯醛麻醉，取靜脈血5 mL 經肝素抗凝后混勻，采用LBYN7500B 型全自動血液流變儀（北京普利生儀器有限公司）檢測血漿黏度、全血黏度、血細胞比容。

1.4.3 心肌組織HE 染色 各組大鼠用10%水合氯醛麻醉，取心肌組織經4%多聚甲醛固定24 h 后，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制成5 μm 切片，進行HE 染色，Nikon E600 型光學顯微鏡（日本Nikon）下觀察心肌組織病理變化。

1.4.4 血清中LDH、CK 和NO 檢測 各組大鼠用10%水合氯醛麻醉，取血3500 r/min 離心10 min，分離血清，按試劑盒說明書分別測定血清LDH、CK、NO 含量。

1.4.5 心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量檢測 各組大鼠用10%水合氯醛麻醉，稱取一定量心肌組織，制成10%的組織勻漿液，離心取上清，考馬斯亮蘭試劑盒測定蛋白含量。按照試劑盒操作測定心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 及MDA 含量。

1.4.6 Western blot 檢測心肌組織中PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白表達 稱取100 mg 心肌組織，加入液氮在研缽中充分研磨后，加入裂解液混勻，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清；BCA 試劑盒測定蛋白濃度，調整蛋白濃度；蛋白變性后，上樣、電泳、轉膜；加入一抗4℃下孵育過夜，清洗后加入二抗孵育1 h，加入ECL發光液曝光，掃描圖像后分析結果，目的蛋白與內參GAPDH 條帶的灰度值比值為目的蛋白的相對含量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二氫槲皮素對心肌缺血模型大鼠全血黏度、血漿黏度和血細胞比容的影響

與空白組比較，模型組全血黏度、血漿黏度、血細胞比容均明顯升高（P ＜0.05）；與模型組比較，地奧心血康組和二氫槲皮素高、中、低劑量組血漿黏度均降低（P ＜0.05），地奧心血康組和二氫槲皮素中、低劑量組血細胞比容明顯降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

2.2 二氫槲皮素對心肌組織病理學的影響

光學顯微鏡下可見，與空白組比較，模型組心肌纖維斷裂，結構紊亂，細胞腫脹、融合呈空泡樣變性壞死，細胞核固縮或脫失，間質水腫，有大量炎癥細胞浸潤。同時，與模型組比較，二氫槲皮素組隨著給藥劑量的增加，心肌病理損傷程度逐漸減輕，表現為心肌纖維排列較規整，變性壞死灶減小，水腫和炎癥細胞浸潤減輕。以地奧心血康組和二氫槲皮素高劑量組病理改善最為明顯。

表1 二氫槲皮素對心肌缺血模型大鼠全血黏度、血漿黏度和血細胞比容的影響（，n=6）

表1 二氫槲皮素對心肌缺血模型大鼠全血黏度、血漿黏度和血細胞比容的影響（，n=6）

注：與空白組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。“-”表示無數據

2.3 二氫槲皮素對急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK 和NO 的影響

與空白組比較，模型組大鼠LDH、CK 水平明顯增加（P ＜0.05），NO 水平明顯降低（P ＜0.05）；與模型組比較，地奧心血康組和二氫槲皮素高、中劑量組LDH、CK 水平均明顯降低（P ＜0.05），地奧心血康組和二氫槲皮素高、中、低劑量組NO 水平均明顯增加，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

2.4 二氫槲皮素對急性心肌缺血大鼠心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織SOD、CAT、GSH-Px 水平明顯降低，MDA 水平明顯升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與模型組比較，地奧心血康組、二氫槲皮素各劑量組大鼠心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 水平明顯升高，MDA 水平明顯降低，差異有 統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

圖1 各組大鼠心肌組織的病理形態變化（HE 染色，200×）

表2 二氫槲皮素對急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK和NO 的影響（，n=6）

表2 二氫槲皮素對急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK和NO 的影響（，n=6）

注：與空白組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。NO：一氧化氮；LDH：乳酸脫氫酶；CK：肌酸激酶。“-”表示無數據

2.5 二氫槲皮素對急性心肌缺血大鼠心肌組織中PI3K、AKT、GSK-3β 蛋白相對表達量的影響

與空白組比較，模型組心肌組織中PI3K 蛋白的相對表達量明顯降低（P ＜0.05），GSK-3β 蛋白的相對表達量明顯升高（P ＜0.05），而兩組PKB 蛋白的相對表達量比較差異無統計學意義（P ＞0.05）；與模型組比較，地奧心血康組和二氫槲皮素各劑量組大鼠心肌組織中PI3K 蛋白的相對表達量均明顯升高（P ＜0.05），地奧心血康組和二氫槲皮素高、中劑量組GSK-3β 蛋白的相對表達量明顯降低（P ＜0.05）；各組PKB 蛋白的相對表達量比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2、表4。

表3 二氫槲皮素對急性心肌缺血大鼠心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 的影響（，n=6）

表3 二氫槲皮素對急性心肌缺血大鼠心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 的影響（，n=6）

注：與空白組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；MDA：丙二醛。“-”表示無數據

圖2 各組大鼠心肌組織PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白的表達

3 討論

二氫槲皮素是由松科植物落葉松中提取分離出的二氫黃酮類高純度天然化合物。藥理研究表明，二氫槲皮素能夠對抗異丙腎上腺素所致心肌組織缺血，保護心肌細胞免受損傷，從而起到治療冠心病的作用[3]；能夠提高細胞內抗氧化酶活性，對過氧化氫（H2O2）誘導H9c2 心肌細胞損傷有保護作用[4]；能夠抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡[5]；能通過抗氧化作用減少氧自由基產生，對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷起到保護作用[6]。

心肌缺血過程中心肌損傷是由體內外多種因素通過多種途徑綜合作用所導致的。氧化應激是心肌損傷級聯反應中的關鍵環節，參與多種信號途徑所引起的心肌損傷和細胞凋亡。近年來研究發現PI3K/GSK-3β 信號通路是機體中重要的細胞內信號轉導通路，可以參與調節細胞分化、增殖，促進細胞生存，及維持細胞正常功能的信號傳遞，在對抗心肌缺血再灌注損傷、抑制心肌細胞凋亡中起到重要作用[7-8]。

表4 二氫槲皮素對急性心肌缺血大鼠心肌組織中PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白相對表達量的影響（，n=3）

表4 二氫槲皮素對急性心肌缺血大鼠心肌組織中PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白相對表達量的影響（，n=3）

注：與空白組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；PKB：磷酸化蛋白激酶B；GSK-3β：糖原合成酶激酶-3β。“-”表示無數據

研究表明，PI3K[9-11]激活并與PKB 相結合，使PKB 從胞漿轉移到細胞膜上，同時PKB 上Ser473 發生磷酸化形成p-Akt[12]，作用于相應的下游靶點，如一氧化氮合酶、GSK-3β[13-14]、半胱氨酸蛋白酶-9[15-17]等，從而減少mPTP[18-20]的開放，維持細胞內各種離子濃度的穩定，改善線粒體能量代謝等功能，可見，PI3K/GSK-3β信號通路是細胞內各種離子濃度穩定的主要通路。

本研究結果顯示，二氫槲皮素能夠降低急性心肌缺血模型大鼠血液流變學全血黏度，降低血清中LDH、CK 水平，升高NO 水平，明顯升高模型大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT 水平和PI3K 蛋白表達，降低血清MDA 水平和心肌組織GSK-3β 蛋白表達。提示二氫槲皮素可能通過調控PI3K/GSK-3β 信號通路，抑制氧化應激級聯反應，調節心肌血流量，阻斷心血缺血的進程，從而發揮抗心肌缺血的作用。而更深入的機制尚不十分清楚，以后還需要進一步的探討和研究。