結直腸癌組織中DNA 甲基轉移酶-1和鈉氫交換子調節因子1 的表達、臨床意義及相關性

高曉斌 武雪亮 趙軼峰 聶雙發 梁 峰 劉小飛 張迎春

1.河北北方學院附屬第一醫院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫院小兒外科，河北張家口 075000

最新流調數據顯示，2014 年我國結直腸癌發病例數上升至第三，其整體5 年生存率并未有明顯提高，較歐美仍有較大差距[1-2]。目前，手術輔以放化療在結直腸癌的治療中已非常成熟，從分子生物學角度尋求敏感度高、特異性強的標志物以提高腫瘤的早期診斷率已成為結直腸癌的研究熱點[3]。

DNA 甲基轉移酶是人類表觀遺傳學中催化并維持DNA 基化結構和功能的重要酶家族[4]，其包含3 個重要成員：DNMT1、DNMT2 和DNMT3，其中DNMT1是目前研究最為廣泛也最為深入的酶類，其在DNA修復和正常甲基化功能過程中發揮關鍵作用。研究證實，DNMT1 的活性增強或表達上調能介導DNA 異常甲基化，與胃癌、胰腺癌、宮頸癌等腫瘤的發生、發展密切相關[5-7]，但在結直腸癌中的研究較少。鈉氫交換子調節因子-1（NHERF1）是近年來發現的一種新的抑癌基因，目前僅在乳腺癌、胃癌中發現其抑癌作用[8-9]，在結直腸癌中的研究尚未見報道。本研究通過對結直腸癌和相應正常組織中DNMT1、NHERF1 行熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和免疫組織化學檢測，探討二者在結直腸癌中的表達情況及與相關臨床病理因素間的關系，同時初步探討二者的相互作用，為結直腸癌的早期診斷和預后監測提供可靠的分子生物學標志物，為結直腸癌的靶向診療提供科學參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017 年2 月～2018 年2 月河北北方學院附屬第一醫院（以下簡稱“我院”）普通外科手術切除病理確診的結直腸癌組織和癌旁正常組織標本各50 例，同時收集患者完整的臨床資料，本研究經我院醫學倫理委員會鑒定批準。

1.2 主要試劑、儀器

RNA 逆轉錄試劑（批號：RI90401）、PCR 試劑盒（批號：9AG03J）、PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒（批號：PR036A）購自日本TaKaRa 公司；DNMT1、NHERF1和β-catenin 引物由生工生物（北京）有限公司設計合成，全自動電化學發光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司E2010，DEPC 水購自美國Sima 公司，DNMT1 抗體、NHERF1 抗體均購自美國Santa Cruz 公司，DAB 顯色試劑盒（批號：PV9000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 檢測癌組和正常組中DNMT1 mRNA和NHERF1 mRNA 表達 按TRIzol RNA 試劑盒說明書提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒逆轉錄合成cDNA 2 μL 逆轉錄產物進行PCR 擴增，PCR 擴增引物：DNMT1 正向引物：5′-CGATGAGGAAGTCGATGATAACAT-3′，反向引物：5′-ATGCGATTCTTGTTCTGTTTCTTCT-3′；NHERF1 正向引物：5′-AGGGAAACTGACGAGTTCTT-3′，反向引物：5′-ACTGAACCTGACCGTACATT-3′；β-catenin 作 為 內參，正向引物：5′-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3′，反向引物：5′-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3′。PCR 反應條件：95℃變性10 min，進行40 個循環：95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，然后根據SYBR Green 染色法行相對定量分析，實驗數據處理使用2△△Ct法，計算各樣本Ct 平均值[IACt 平均值（Ct=Ctnetl-Ctl3actin），計算2△△ct（mean2△△ct值）AACt=meanAACt 值。

1.3.2 免疫組織化學法檢測癌組和正常組中DNMT1和NHERF1 蛋白陽性表達 將癌組織標本連續切片4 μL 貼附于經多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，光鏡下觀察切片中DNMT1、NHERF1 蛋白的表達和分布情況，每張切片選取5 個高倍視野（400×）。DNMT1 蛋白陽性主要分布于細胞核中，而NHERF1蛋白陽性主要分布于細胞質和細胞膜中，均呈棕黃色顆粒。判斷標準：按染色強度[10]：無著色為0 分，淡黃為1 分，深黃2 分，棕褐或棕黃3 分；陽性細胞計數：＜10%為0 分，10%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分，兩者相加＜2 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中等強度陽性（++），6～7 分為強陽性（+++），由兩名具備高級職稱的病理醫師經雙盲法獨立評分。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。應用Spearman 相關分析法分析二者的相關性。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組和正常組中DNMT1 mRNA、NHERF1 mRNA 表達

qRT-PCR 結果以目標基因與β-catenin 的比值作為定量分析結果，癌組中DNMT1 mRNA 的表達水平為（0.36±0.07），明顯高于正常組（0.09±0.01）；而癌組中NHERF1 mRNA 的表達水平為（0.14±0.03），明顯低于正常組（0.35±0.05），差異均有高度統計學意義（t=10.951、6.553，均P=0.000）。

2.2 結直腸癌組和正常組中DNMT1 和NHERF1 蛋白的表達

免疫組化結果顯示癌組中DNMT1 陽性表達率為84.00%（42/50），明顯高于其在正常組中的陽性表達24.00%（12/50）；而癌組織中NHERF1 陽性表達率為32.00（16/50），明顯低于其在正常組中的表達[76.00%（38/50）]，差異均有高度統計學意義（χ2=21.545、15.559，均P=0.000）。見圖1。

2.3 DNMT1 和NHERF1 蛋白的表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

DNMT1 和NHERF1 蛋白表達均與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結轉移及肝轉移相關（均P ＜0.05）。TNM 分期高，DNMT1 表達水平越高，而NHERF1 表達水平越低（均P ＜0.05），伴淋巴結轉移、肝轉移的患者DNMT1 表達水平高于未轉移的患者，而NHERF1的表達水平則低于未轉移患者（均P ＜0.05），而DNMT1 和NHERF1 蛋白表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度均無關（均P ＞0.0505）。見表1。

2.4 結直腸癌組織中DNMT1 和NHERF1 蛋白表達的相關性

DNMT1 和NHERF1 蛋白表達呈負相關（r=-0.491，P=0.000）。見表2。

3 討論

研究證實，腫瘤的發生、演變不單單取決于遺傳因素，同時也受到表觀遺傳修飾的影響，后者通過DNA 甲基化、染色體重塑、組蛋白修飾和lncRNA 等4 種主要的調控方式來調控腫瘤相關基因的表達，激活致癌基因，沉默抑癌基因，其中DNA 甲基化是目前研究最為深入的機制[11]。

圖1 免疫組化檢測DNMT1、NHERF1 在結直腸組織和癌組織中的表達（SP 法，200×）

表1 臨床病理因素與DNMT1 和NHERF1 在結直腸癌組織中陽性表達的關系[例（%）]

表2 結直腸癌組織DNMT1 和NHERF1 表達的相關性

DNMT1 是DNA 甲基化的關鍵作用酶，主要介導甲基化模式的建立與維護，其高表達可以誘導甲基化模式異常，使啟動子區的CpG 島發生甲基化，相關調控基因表達受抑制，從而介導腫瘤發生[12-13]。張尤歷等[14]檢測DNMT1 mRNA 和蛋白在胰腺組織中的表達，發現二者在癌組織中的表達水平和陽性率均明顯高于正常組織，且其表達強度與腫瘤的惡性度、淋巴結轉移和神經浸潤密切相關；羅玉政等[15]通過小分子干擾劑抑制人結腸癌HT-29 細胞DNMT1 的表達，證實DNMT1-siRNA 能明顯抑制HT-29 細胞的增殖、促進其凋亡，降低其侵襲和遷移的能力。

NHERF-1 最初發現于人類上皮細胞，在肝臟、腎臟、胰腺、唾液腺、乳腺中均有表達，NHERFl 基因定位于染色體17q25.1，含6 個外顯子，其編碼蛋白質N端含有PDZ-I 和PDZ-II 兩個結構域，C 端含有與ERM 家族蛋白結合的結構域[16]。NHERF-1 通過PDZ和ERM 結構域與包括血小板衍生生長因子受體、磷酸酶基因（PTEN）、脾酪氨酸激酶（SYK）等在內的多種靶蛋白質相互結合，參與調節多種信號傳導途徑，如Wnt 信號通路、PI3K/PTEN/Akt 通路、Hippo-YAP/TAZ 等，其中Wnt 信號通路在腫瘤細胞的增殖、侵襲及血管形成、浸潤等方面發揮重要作用[17]。李陽等[18]應用免疫組織化學法檢測乳腺癌組織及癌旁組織中NHERF-1 蛋白表達情況，發現癌組織中NHERF1 呈現弱陽性或不表達狀態，而在癌旁正常組織中兩者均有表達或高表達，考慮抑制NHERF1 蛋白的表達與乳腺癌發生關系密切。

本研究顯示，DNMT1 在結直腸癌組織中表達明顯高于正常組，而NHERF1 癌組織中的表達明顯低于正常組，差異明顯，提示在腸黏膜癌變的過程中，DNMT1 的過表達和NHERF1 的表達受抑制參與結直腸腫瘤的發生；進一步研究顯示，DNMT1 和NHERF1表達水平與結直腸癌的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結和肝轉移均關系密切，且二者表達呈負相關。有研究表明：DNMT1 和NHERF1 均受Wnt 信號傳導途徑調節，在DNMT1 高表達結直腸癌患者中，Wnt 信號通路與NHERF1 表達呈負相關，DNMT1 能抑制體內NHERF1 的表達[19]；亦有研究證實，NHERF1 是Wnt信號通路的拮抗劑之一，NHERF1 通過抑制Wnt 通路降低DNMT1 的表達，從而抑制DNA 的異常甲基化，誘導腫瘤的發生[20]。

綜上，DNMT1 和NHERF1 的異常表達對結直腸癌的發生進展有重要作用，本研究僅從基因和蛋白水平分析二者在結直腸癌組織中的表達情況，其具體的相互作用機制及相關通路的研究尚不明確，這也是本研究下一步的研究方向。