結腸癌組織中miR-29b、Tiam1 的表達及臨床意義

楊曉波 吳 淼 彭孟寅 李 崗 左 強

1.四川省宜賓市第二人民醫院胃腸外科，四川宜賓 644000；2.安徽省亳州市人民醫院胃腸外科，安徽亳州 236800

結腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，具有較高的發病率與死亡率，近幾年隨著人們生活方式的改變，結腸癌發病率呈現逐年增長及年輕化的趨勢[1-2]。腫瘤淋巴轉移是結腸癌患者死亡的主要原因，結腸癌發病機制較為復雜且尚未明確[3-4]。MicroRNA（miRNA）是一類由18～25 個氨基酸組成的非編碼小分子RNA[5]，其能夠與靶向基因mRNA 上的特定序列互補配對，促使mRNA 發生降解或者抑制翻譯的進行[6]。miRNA 與腫瘤的發生發展相關，是一種具有組織高度特異性的腫瘤標志物[7]，其在多種組織中表達異常下調[8]，miR-29b 作為miRNA 中的一大家族，在多種腫瘤如胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等[9]中表達降低；T 淋巴瘤侵襲和轉移誘導因子1（Tiam1）是鳥氨酸轉換因子（GEFs），參與多種腫瘤的侵襲和轉移，在甲狀腺癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌等多種腫瘤細胞中呈現高表達，其表達與腫瘤細胞的侵襲轉移關系密切[10]，但是關于miR-29b 和Tiam1 在結腸癌中的表達情況的文獻報道較少。本研究主要探究結腸癌中miR-29b、Tiam1 的表達情況及臨床意義，為臨床結腸癌的治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年5 月～2018 年5 月在四川省宜賓市第二人民醫院（以下簡稱“我院”）行手術治療的結腸癌患者，納入標準：①患者符合中國結直腸癌診療規范[11]；②病理檢查確診為結腸癌，具備結腸癌典型的臨床癥狀；③患者術前未接受過任何腫瘤治療；④具有完整的病歷資料；⑤患者及其家屬同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①患有嚴重心血管疾病及肝腎功能不全者；②患有其他類型惡性腫瘤；③患有自身免疫疾病、嚴重感染疾病者。

選取符合納入標準的患者81 例，男45 例，女36 例；年齡39～80 歲，＜50 歲患者38 例，≥50 歲患者43 例，平均年齡（58.35±8.92）歲；腫瘤直徑：＜6 cm 39 例，≥6 cm 42 例；細胞分化程度：低分化24 例，中、高分化57 例；淋巴結轉移50 例，無淋巴結轉移31 例；TNM 分期按照國際抗癌聯盟腫瘤TNM 分期圖譜：Ⅰ～Ⅱ期64 例，Ⅲ期17 例。本研究通過我院醫學倫理委員會審核、批準。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol 試劑購自北京拜爾迪生物技術有限公司；反轉錄試劑盒TransScript Two-Step RT-PCR Super Mix（生產批號：M20105）和qRT-PCR 試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix（生產批號：J21018）均購自北京全式金生物技術有限公司；本研究涉及引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.3 miR-29b 和Tiam1 在不同組織中的表達

手術中選取結腸癌患者癌組織、距離癌組織邊緣5 cm 外癌旁組織標本切除后立即放置于液氮中，轉移至-80°C 冰箱保存，液氮速凍，取100 mg 左右的組織，研磨成粉末，利用Trizol 試劑提取總RNA，獲得的RNA 立即放置于冰上，利用紫外分光光度計，檢測RNA 的濃度與質量。取1 μg RNA（剩余RNA 儲存于-80°C 冰箱），按照TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix 試劑盒操作說明書，將提取得到的RNA 反轉得到cDNA，反轉得到的cDNA 保存于-20℃冰箱。采用Real-time PCR 對miR-29b 和Tiam1 進行相對定量分析，qRT-PCR 擴增采用TransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒，PCR 反應體系參照說明書進行，STBR Premix Ex Taq Mix 17 μL，模板1.0 μL，上游與下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，總體系為20 μL。反應程序：95℃3 min，95℃30 s，55℃30 s（每次循環后采集熒光），進行35 個循環。數據分析利用Bio-Rad CFX Manager 軟件，判斷RT-PCR 產物的特異性可以根據溶解曲線，相對定量分析采用2-ΔΔCt方法進行分析。定量PCR 所用引物：miR-29b 上游引物序列5′-GCGCGCTAGCACCATTTG-3′，下游引物序列5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；其內參引物U6 上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。Tiam1 上游引物序列5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3′，下游引物序列5′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′，其內參引物GAPDH上游引物序列5′-ACTTCAACAGCGACACCCACT-3′，下游引物序列5′-GCCAAATTCGTTGTCATACCAG-3′，每個樣品重復3 次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；采用Pearson 相關系數進行相關性分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-29b 和Tiam1 在不同組織中的表達分析

miR-29b 在癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織（P ＜0.05），Tiam1 在癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 不同組織中miR-29b 和Tiam1 的表達水平比較（）

表1 不同組織中miR-29b 和Tiam1 的表達水平比較（）

2.2 結腸癌患者組織中miR-29b、Tiam1 表達與患者臨床病理特征的關系

結腸癌患者組織中miR-29b、Tiam1 表達與腫瘤TNM 分期、分化程度以及淋巴結轉移情況相關（P ＜0.05），與患者年齡、性別、腫瘤直徑無關（P ＞0.05）。見表2。

2.4 癌組織中miR-29b mRNA 與Tiam1 mRNA 表達的相關性

癌組織中miR-29b mRNA 與Tiam1 mRNA 表達呈負相關y=-9.472x+8.981（r=-0.381，P ＜0.05）。見圖1。

表2 結腸癌患者組織中miR-29b、Tiam1 表達量與患者臨床病理特征的關系（）

表2 結腸癌患者組織中miR-29b、Tiam1 表達量與患者臨床病理特征的關系（）

圖1 miR-29b mRNA 與Tiam1 mRNA 表達的相關性

3 討論

miRNA 在腫瘤的發生、侵襲等過程中發揮著重要作用，作為一種具有調控功能的小分子RNA[12]。miR-29 家族在多種腫瘤中充當著抑癌基因的角色，其能夠抑制腫瘤的發生、發展，促進細胞凋亡，具有免疫調節作用[22]。miR-29a、miR-29b、miR-29c 是miR-29 家族主要成員，其中miR-29b 是miR-29 家族最重要的成員，miR-29b 能夠調控不同分子的表達，調控各種類型分子在細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等不同階段的表達，促進機體參與各項生命活動，故miR-29b可以作為多種腫瘤增殖、擴散等過程的信號分子[13]。Tiam1 由小鼠T 淋巴瘤細胞中鑒定得到，含有1591 個氨基酸，含有DH 與PH 兩個功能結構域，是一種原癌基因[14]。Tiam1 是最重要的GEFs 成員之一，能夠調節Rho 蛋白家族活性，影響細胞骨架形成、調控基因表達，在細胞周期進程、細胞遷移及黏附等生命活動過程中起到重要作用[14]。

大量研究表明，miR-29b 能夠在胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等[9]腫瘤細胞中表達，但是在不同腫瘤細胞中表達量有所差異。miR-29b 的表達受多種因素調控影響，如缺失表達、其他miRNA 的調控以及染色體的不穩定性等[15]。本研究中，miR-29b 在結腸癌組織中的表達量明顯低于癌旁組織，提示miR-29b 可能參與結腸癌的發生發展，表現出抑癌基因的功能。MiR-29b 可能是由于啟動子區域CpG 島甲基化沉默，被充當抑癌基因的角色，miR-29b 能夠通過RISC 機制結合靶基因上的3′UTR，并下調該基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的進一步增殖、擴散、侵襲、遷移以及促進細胞凋亡[16-17]，充當抑癌基因的角色，參與結腸癌的發生、發展。進一步分析發現，結腸癌患者組織中miR-29b 的表達與腫瘤TNM 分期、細胞分化程度以及淋巴結轉移密切相關，說明miR-29b 與結腸癌的轉移、分化、擴散密切相關，在腫瘤形成與凋亡過程中發揮著重要作用。

Tiam1 作為GEF 家族成員，是腫瘤發生、發展的潛在調節因子，其在甲狀腺癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌等多種腫瘤細胞中呈現高表達[10]，本研究顯示Tiam1在結腸癌中表達量高于癌旁組織，且與TNM 分期、細胞分化程度以及淋巴結轉移密切相關，提示Tiam1 能夠參與誘導結腸癌轉移等過程，表現出癌基因的作用，其表達能力與腫瘤的轉移能力密切相關，其誘導轉移機制可能與以下幾點密切相關：①膜褶皺強弱與細胞侵襲、轉移能力呈正相關。研究表明，外源過表達Tiam1 后，膜褶皺比例顯著增加，說明Tiam1 能夠誘導膜褶皺增加，促進癌細胞的轉移、發展[19]。②Tiam1 PH區能夠參與蛋白與蛋白之間的相互作用，形成蛋白復合物，確定Tiam1 蛋白在細胞膜上的定位結果，影響細胞的黏附分子[20]。③Racl 能夠影響肌動蛋白的細胞骨架的組成，而Tiam1 在體內外均能夠特異性地激活Racl，影響細胞骨架的組裝，進而影響細胞運動、黏附以及形態的變化等[21]，Tiam1 誘導機制決定了Tiam1 在腫瘤發生、發展過程中的作用，其能夠表現癌基因的作用，其表達量的變化能夠指示癌組織的擴散、發生、發展等過程，具有良好的指示作用。

相關性分析結果顯示，結腸癌組織中miR-29b與Tiam1 表達呈負相關，可能是因為miR-29b 可能直接作用于Tiam1，激活Tiam1-Rac 信號，miR-29b 與Tiam1 共同作用，促進結腸癌細胞的發展。褚慶華等[22]研究發現miR-29c 通過Tiam1 抑制人食管鱗狀細胞癌的轉移與侵襲，改變細胞的運動狀態，與本研究結果相似。Wang 等[23]發現Tiam 1 是miR-29b 的直接靶點，與miR-29b 修復誘導的表型不同，Tiam1 誘導的細胞增殖和遷移部分地挽救了miR-29b 介導的生物學行為，說明兩者相互作用，在結腸癌分子治療中具有潛在的價值。

綜上所示，miR-29b 在結腸癌患者低表達，而Tiam1 則高表達，兩者相互作用共同參與結腸的發生發展及轉移。