外周血HFLC及IG在腦出血患者細菌性血流感染中的應用價值

李春艷，杜振華，劉 錦

(1.天津醫科大學眼科醫院 檢驗科，天津300190；2.武警后勤學院附屬醫院 檢驗科，天津300162)

目前血培養是診斷的血流感染(BSI，bloodstream infection)的金標準，但是由于耗時長，其診斷效率低下，而C反應蛋白(CRP，C reactive protein)、前降鈣素原(PCT，Procalciton)等感染指標影響因素多且成本高[1]，因此尋找能夠在早期快速方便診斷BSI的指標一直是感染診療的迫切需求。高熒光強度淋巴細胞(HFLC，high fluorescence lymphocytes)和不成熟粒細胞(IG，immature granulocytes)是新一代Sysmex血細胞分析儀提供的研究參數，研究發現IG百分比可以預測新生兒膿毒血癥和血液感染[2]，也有研究發現其在成人感染患者中水平升高[3-5]。本研究旨在探索Sysmex XE-5000全自動血常規分析儀提供的IG和HFLC參數對ICU中腦出血患者不同程度感染(局部感染和血流感染)的區分能力，并利用Logistic回歸分析建模，評估其與PCT、CRP指標聯合檢測是否能提高對血流感染的診斷能力。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取武警后勤學院附屬醫院2014年3月至2015年7月腦科ICU病房腦出血住院患者64例，其中男50名，女14名，年齡平均51.67±14.76歲，包含19例未感染患者(NOI，至少連續7天痰、尿、腦脊液培養均為陰性，并結合影像學特征、體溫及臨床癥狀判定)；27例局部感染患者(LCI，痰或尿標本培養陽性，而血培養陰性)和18例BSI患者(血培養陽性)。血培養陽性樣本中可見人葡萄球菌、白色念珠菌、近平滑假絲酵母菌、銅綠假單胞菌等。以同期健康體檢中心體檢合格的121名健康人作為對照組(HC)，其中男95名，女26名，年齡平均56±10.40歲。各組間年齡、性別、職業構成等方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。病例資料中排除其它自身免疫性疾病、傳染性疾病(如HBV、HCV、HIV感染患者)、腫瘤、外傷、貧血、嚴重肝腎損害等。本研究得到醫院醫學倫理委員會批準，并獲得所有患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1樣本采集與處理 樣本的采集和檢測連續7天留取可能引發感染的腦出血患者標本(包括血液、尿液或痰液標本)，以評估患者的感染情況。記錄患者首次血液培養時，檢測的HFLC、IG、PCT、CRP，1-3-β-DG和Endotoxin參數。健康對照只檢測HFLC和IG。所取血液樣本(5 ml)， 3 500 r/min離心10 min后取血清檢測。采用全自動免疫速率散射比濁法測定C反應蛋白(CRP)。采用免疫熒光法檢測PCT。采用光濁度法檢測1-3-β-DG和Endotoxin。白細胞計數(WBC)、高熒光強度淋巴細胞(HFLC)和未成熟粒細胞(IG)檢測在Sysmex XE-5000全自動血液細胞分析儀上進行。所有試驗固定操作人員，嚴格按照儀器操作規程說明操作。試劑、質控品及校準品均在有效期內，實驗前用各自的校準物定標，試驗中采用各自配套的質控物對儀器運行狀態進行監控。

1.2.2儀器與試劑 Sysmex XE-5000全自動血液細胞分析儀及其原裝配套試劑(包括在線質控品)均來自日本希森美康公司。德國SIMENS BNII 全自動免疫散射比濁儀及其配套試劑(包括質控品)。法國梅里艾VIDAS全自動免疫熒光酶標儀及其配套前降鈣素原(PCT)試劑。北京金山川MB-80微生物快速動態檢測系統及與其配套的1,3-β-D葡聚糖(1,3-β-DG)檢測試劑和脂多糖(LPS)檢測試劑。靜脈真空采血管采用廣州陽普醫療科技股份有限公司生產的EDTA-2K抗凝管和普通干燥管。

1.3 數據處理

2 結果

2.1 血細胞檢測結果

NOI組[(0.0556±0.0041) ×109/L，(0.0114±0.0057) ×109/L]、LCI組[(0.0857±0.0103)×109/L，(0.0102±0.0063)×109/L]、BSI組[(0.1503±0.0208)×109/L，(0.0255±0.0047)×109/L]的IG和HFLC水平均顯著高于健康對照組[(0.0113±0.0035)×109/L，(0.0011±0.0024)×109/L](P<0.05)；BSI組兩參數水平顯著高于LCI組(P<0.05)；但LCI組和NOI組間兩參數水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1(a、b)。NOI組(13.58±5.61)×10。9/L、LCI組(14.83±7.06)×109/L、BSI組(13.46±7.69)×109/L WBC水平顯著高于健康對照組(5.9±1.79)×109/L(P<0.05)，但3組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1 各組間HFLC(a)、IG(b)、CRP(c)、PCT(d)水平比較

2.2 腦出血患者各組間CRP、PCT水平比較

NOI組、LCI組、BSI組間CRP水平差異無統計學意義(P>0.05)，分別為(46.7±11.92) mg/L、(74.07±11.15) mg/L、(79.29±24.74) mg/L。BSI組PCT水平(11.96±11.56) ng/mL顯著高于NOI組(0.72±0.47) ng/mL和LCI組(2.82±4.68) ng/mL(P<0.05)，但后兩組間差異無統計學意義(P>0.05),見表1，見圖1(c、d)。

表1 各組檢測參數比較

注：*與健康對照組相比P<0.05；#與未感染組相比P<0.05；△與局部感染組相比P<0.05。

2.3 IG、HFLC、CRP、PCT及HFLC和PCT聯合檢測對BSI的診斷效能分析

五參數的ROC曲線下面積為分別為0.725(0.580,0.869)、0.708(0.555,0.860)、0.551(0.374,0.728)、0.808(0.680,0.936)、0.841(0.725,0.957)。當界值設為大于等于0.2343×109/L時，IG的靈敏度和特異度分別為100%和42.2%；當界值設為大等于0.1573×109/L時，HFLC的靈敏度和特異度分別為57.1%和77.8%；當界值設為大于等于0.9899時，PCT的靈敏度和特異度分別為92.9%與62.2%。HFLC和PCT聯合檢測，其靈敏度和特異性與單獨檢測PCT無明顯差異，見圖2。

圖2 IG,HFLC,CRP,PCT及HFLC和PCT聯合檢測對BSI的診斷能力比較

2.4 IG、HFLC與CRP、PCT、LPS、1,3-β-DG的相關性

HFLC與1-3-β-DG正相關(r=0.346,P<0.05)，與其它參數無相關性。IG與PCT正相關(r=0.284,P<0.05)，與其它參數無相關性，見表2。

表2 HFLC、IG與各參數相關系數

2.5 HFLC、IG、PCT、CRP的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析各參數見表3，發現只有HFLC和PCT與模型的預測能力顯著相關(P<0.05)。得到Logistic回歸方程為P=1/(1+e-3.22+0.12HFLC+0.75PCT) ，擬合ROC曲線獲得HFLC與PCT聯合聯合檢測時,對腦出血患者BSI的診斷準確性(ROC曲線下面積)達到0.871(0.766,0.977)，界值為0.181時,敏感度增加到85.7%,特異度為75.6%。

表3 HFLC、IG、PCT、CRP Logistic回歸分析模型參數

3 討論

Sysmex XE-5000全自動血液分析儀器通過新增的核酸熒光染色通道與散射光通道結合可以給出新的研究參數：高熒光強度淋巴細胞(HFLC)[5]和不成熟粒細胞(IG)，已有研究證實其對感染性疾病的診斷有一定的意義[3,6，7]。本研究發現BSI組患者IG、HFLC計數較非BSI組高，與已有報道的結果一致[4,6,9，10]。但是IG、HFLC未能區分LCI組和NOI組，這可能是由于本研究選擇的腦出血患者早期的創傷應激反應較強，掩蓋了IG、HFLC的早期變化。這點也可以反映在CRP指標上，本研究發現BSI組、LCI組、NOI組的CRP差異也無統計學意義，與一些報道的研究結果不同[6,11]。 PCT是已被證明的能夠預測BSI的標志物[12,13]，本研究發現其診斷效能最高。HFLC和IG的ROC曲線下面積均>0.7表明二者判斷BSI效能均較好。IG的靈敏度好但特異度差，HFLC則相反，可見IG具有較好的陰性預測價值，而HFLC則具有一定的陽性預測價值。這可能是因為BSI主要由細菌感染引發，粒細胞(包括IG)對此比較敏感，而HFLC反映的是機體在淋巴細胞受激發后的反應狀態。在利用Logistic回歸分析建立HFLC、IG、CRP、PCT 4項指標聯合檢測的模型時發現，HFLC對PCT的診斷效能有明顯的增幅作用，IG則沒有。造成這個結果，一方面可能是由于PCT與IG所指示的機體感染反應功能重疊(IG與PCT相關)，造成IG無法為PCT提供額外的診斷信息；另一方面則是由HFLC所代表的細胞決定的，研究發現HFLC反映外周血中產生抗體的漿細胞[14]，且這部分漿細胞在感染早期通過非T細胞依賴的B淋巴細胞激活途徑產生。血流感染時，微生物直接刺激B淋巴細胞增殖與復制，在此過程中被T淋巴細胞識別，使其中一部分抑制性T淋巴細胞激活后大量增殖轉化，細胞合成蛋白和核酸增強，也表現為HFLC計數的增高[15]。本研究還發現LPS與CRP、PCT、IG、HFLC均無相關性，可見IG與HFLC與CRP、PCT指標一樣與感染細菌的種類無關。而HFLC與1-3-β-DG正相關，可能與真菌表面1-3-β-DG在機體早期免疫反應調節中的作用有關。但由于分組比例較少，本結論有一定的誤差，這點尚需進一步研究。

隨著流式技術與傳統血常規分析技術的結合，現代血常規分析儀提供越來越豐富的細胞相關參數，但是其臨床應用還停留在傳統的分類計數模式當中，如何發掘這些新參數的臨床價值，為臨床疾病的診療提供更便捷、豐富的信息，應當成為檢驗工作者思考和解決的問題。本研究發現IG和HFLC計數可以作為臨床上血流感染的判斷提供幫助，IG提供一定的陰性預測價值，而HFLC則提供一定的陽性預測價值。HFLC與PCT聯合檢測可以提高血流感染的診斷效率。血細胞計數是臨床患者的常規檢測項目，隨著新一代血細胞計數儀的普及，IG、HFLC參數的獲取便捷且不會產生額外的費用。由于血細胞計數檢測較其它感染指標的頻率高、門檻低，因此IG、HFLC參數為血流感染的診斷提供極大的幫助。