高原地區(qū)大鼠耳蝸RNA提取條件優(yōu)化

師晶晶，巴 桑，普 珍，石 艷，安 芳，龔嘎藍(lán)孜*

(1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩850000；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院 實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021；3.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院 眼科，西藏 拉薩850000)

RNA是cDNA文庫(kù)的建立、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因克隆等領(lǐng)域非常重要的原材料[1]。目前，RNA的提取方法較多，除最常用的Trizol法[2]外，還有SDS法[3]、CTAB法[4]、試劑盒法[5]等。一般情況下，由于RNA是一種極不穩(wěn)定的生物大分子，可因溫度變化、紫外線照射、pH值等理化因素而發(fā)生降解[6]，因此RNA的提取要求比較嚴(yán)格。青藏高原平均海拔在4500米左右，由于地勢(shì)高而形成了高原特有的低氧、低壓、高寒的氣候特點(diǎn)[7]。有研究報(bào)道在西藏高原環(huán)境下用常規(guī)試劑盒提取DNA會(huì)受到一定的影響[8]。同樣我們發(fā)現(xiàn)在高原環(huán)境下如果按照試劑盒說明進(jìn)行RNA的提取，其產(chǎn)量、純度很難滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。因此，本課題組通過多次研究嘗試，探索出一套AMBION抽提試劑盒提取RNA的優(yōu)化方法，該方法適合在高原環(huán)境下提取RNA，所提取的RNA能獲得滿意的純度和產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2019年7月從成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030)購(gòu)買126只8周齡220±8 g的Wistar大鼠，用大鼠耳蝸組織作為RNA提取的材料。

1.2 主要試劑與儀器

RNA laterTMSolution(Invitrogen公司)，AMBION抽提試劑盒(mirVanaTMmiRNA ISOlation Kit，Ambion，試劑貨號(hào)：AM1561)，醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)，冷凍離心機(jī)(ST16R，Thermo)，微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，Thermo)，Agilent 2100生物分析儀(安捷倫科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將126份大鼠耳蝸樣品每一份分為2組：實(shí)驗(yàn)組(126份)和對(duì)照組(126份)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將126只大鼠耳蝸組織(每只分2份)放在252個(gè)凍存管中，每個(gè)樣本加0.5 ml RNA later， 然后在-20℃冰箱放置1 h(組織要保證不漂浮在表面)，待RNA later浸透后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱。其中126份采用AMBION試劑盒優(yōu)化方法提取RNA作為實(shí)驗(yàn)組，另外126份采用AMBION試劑盒提取RNA作為對(duì)照組。

1.4.1對(duì)照組 對(duì)照組具體操作方法按AMBION試劑盒說明書提取RNA。

1.4.2實(shí)驗(yàn)組 大鼠耳蝸RNA的提取采用AMBION試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和方法進(jìn)行優(yōu)化和改良，具體步驟如下： 1)取適量的組織樣品，加入600 μl Lysis/Binding Buffer，劇烈震蕩混勻，加60 μl miRNA Homogenate Additive，混勻，4℃冰箱靜置20 min。 2)加入等體積(660 μl)酸酚氯仿，13 000 rpm，4℃ 離心5 min，取上清。 3)加1.25倍體積100%乙醇(750 μl)，吹打混勻。 4)將混合液加入柱子中，室溫，13 000 rpm，1 min，棄流過液，重復(fù)此步驟，將混合液全部過柱。 5)加350 μl miRNA Wash Solution 1(提前配制，加入21 ml無水乙醇，終體積30 ml，搖勻)到離心柱中，13 000 rpm，1 min，棄流過液，將離心柱重新放置到收集管中。 6)混合10 μl DNase I和70 μl Buffer RDD QIAGEN (#79254) 總體積：80 μl，加到離心柱中的膜上，室溫放置15 min(此時(shí)要95℃預(yù)熱Elution Solution)。 7)加350 μl miRNA Wash Solution 1到離心柱中，13 000 rpm，1 min，棄流過液，將離心柱重新放置到收集管中。 8)加入500 μl Wash Solution2/3(提前配制，加入40 ml無水乙醇，終體積50 ml，搖勻)過柱3次，13 000 rpm，1 min,棄流過液，將離心柱重新放置到收集管中。 9)空柱離心1 min，將離心柱放置到新的收集管中，柱中心加30 μl 95℃預(yù)熱的Elution Solution，放置2 min。室溫13 000 rpm離心1 min，收集管中的液體即為提取的Total RNA(觀察底部是否有液體，有則丟棄柱子)，-80℃保存。

1.4.3耳蝸組織RNA測(cè)定 RNA含量和純度采用Nanodrop2000分光光度計(jì)測(cè)定。RNA質(zhì)量用Agilent2100生物分析儀測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RNA提取量、濃度、純度比較實(shí)驗(yàn)組RNA提取量與對(duì)照組大致一致(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組RNA濃度比對(duì)照組高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組RNA純度指標(biāo)A260/280比值均在1.8-2.2范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組A260/280高于對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組RNA純度指標(biāo)A260/230均大于1.8，兩組間A260/230無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組RNA提取總量、濃度、純度比較

注*代表實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比P<0.05

2.2 RNA純度(A260/280)比例比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組A260/280比值范圍均在1.8-2.2范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組126份樣品中A260/280比值<1.8的有0份,≥1.8～≤2.1范圍內(nèi)的有109份，>2.1范圍內(nèi)有17份，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組RNA純度(A260/280)比例比較

2.3 RNA質(zhì)量比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組28S/18S值均大于0.7，兩組均值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組RIN均大于7，實(shí)驗(yàn)組RIN大于對(duì)照組RIN(P<0.05)，見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組RNA質(zhì)量比較

注*代表實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比P<0.05

3 討論

RNA是現(xiàn)代分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、臨床疾病等研究的原材料[9]。目前，RNA提取的方法較多，有各種品牌的抽提試劑盒可供選擇。西藏海拔較高，我們發(fā)現(xiàn)在高原特殊的地理環(huán)境下采用試劑盒提取RNA會(huì)受到一定影響。本課題組在平原地區(qū)采用AMBION試劑盒提取大鼠耳蝸組織RNA，按照說明書方法所獲得的RNA純度和濃度都能滿足下游實(shí)驗(yàn)的需要，但在西藏大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心(3658米)按照說明書提取RNA，其濃度和純度都不能滿足下游實(shí)驗(yàn)要求。因此，本課題組經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，總結(jié)出采用AMBION試劑盒在高原地區(qū)提取組織RNA的改良方法：(1)4℃冰箱靜置10 min改為靜置20 min；(2)每次離心時(shí)間13 000 rpm，30 s改為1 min；(3)過柱兩次改為過柱3次；(4)保存溫度-70℃改為-80℃。

改良方法與對(duì)照組說明書方法相比，總實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加25 min左右，結(jié)果顯示采用改良方法提取的RNA濃度和純度比對(duì)照組高、質(zhì)量比對(duì)照組好。

實(shí)驗(yàn)組RNA提取獲得的濃度(0.147±0.047 μg/μl)高于對(duì)照組濃度(0.072±0.022 μg/μl)，可能跟實(shí)驗(yàn)組增加了在4℃冰箱靜置時(shí)間和每次離心時(shí)間，使得RNA沉淀較多有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組純度指標(biāo)A260/280比值(2.096±0.044)高于對(duì)照組(1.900±0.113)，可能跟實(shí)驗(yàn)組增加了一次過柱次數(shù)，導(dǎo)致雜質(zhì)減少，RNA純度增加有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組RNA提取量(0.896±0.348 μg)比對(duì)照組稍高(0.536±0.404 μg)，可能跟實(shí)驗(yàn)組保存溫度由-70℃改為-80℃，使RNA保存更好有關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，RNA純品的A260/280為2.0[6]，A260/280小于1.8說明蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多，A260/280大于2.2說明RNA降解較多[10]。本研究實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組A260/280比值范圍均在1.8-2.2范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組A260/280比例在1.8-2.1范圍內(nèi)的有109份，占86.51%，比對(duì)照組高(43.65%)，實(shí)驗(yàn)組A260/280比例在>2.1范圍內(nèi)有17份，占13.49%，比對(duì)照組低(56.35%)，說明實(shí)驗(yàn)組RNA純度指標(biāo)A260/280滿足實(shí)驗(yàn)要求的比例較多，且RNA降解比對(duì)照組低。另外，高純度RNA的A260/230比值應(yīng)大于2.0，A260/230比值在1.8-2.0范圍內(nèi)時(shí)說明有雜質(zhì)，而雜質(zhì)在允許范圍內(nèi)，當(dāng)A260/230小于1.8時(shí)，則說明純度不夠，不能用于實(shí)驗(yàn)[11]。本研究實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組A260/230比值結(jié)果均在1.8-2.0范圍內(nèi)，兩組均符合RNA純度A260/230的要求[1]。

因此，本課題在高原地區(qū)提取RNA的過程中，按照改良方法增加靜置時(shí)間和離心時(shí)間，以及過柱次數(shù)后，其純度、濃度和質(zhì)量均比對(duì)照組高，且能滿足后期實(shí)驗(yàn)要求，說明在高原低壓低氧環(huán)境中，采用AMBION抽提試劑盒改良方法提取耳蝸組織RNA是切實(shí)可行的。