生存蛋白在膀胱癌患者尿液脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床相關(guān)性研究

徐蘭鋒,朱 丹,袁 潮

(1.錦州市中心醫(yī)院 輸血科,遼寧 錦州121001；2.錦州市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 錦州121001)

膀胱癌是臨床中常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤。70%膀胱癌為淺表性腫瘤，患者復(fù)發(fā)率較高，有20%的患者會(huì)向浸潤(rùn)性腫瘤發(fā)展[1]。目前臨床中關(guān)于膀胱癌的診斷主要依靠膀胱鏡檢查和病理活檢，膀胱鏡是一種侵入性檢查，會(huì)增加患者痛苦，對(duì)患者產(chǎn)生的傷害性較大，可能會(huì)引發(fā)患者尿路感染[2]。尿細(xì)胞學(xué)檢查具有較高的特異性，會(huì)避免尿路感染發(fā)生。王宏磊[3]研究指出，選擇無(wú)創(chuàng)、敏感性和特異性較高的腫瘤標(biāo)志物對(duì)膀胱癌的臨床診斷具有重要意義，已經(jīng)成為臨床研究的熱點(diǎn)。Survivin是凋亡抑制蛋白家族重要的成員，其結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，在細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。Survivin主要在胚胎組織以及大部分腫瘤組織中表達(dá)。李峰[5]研究顯示，Survivin在膀胱移行細(xì)胞癌患者中有表達(dá)，但是在正常組織中未見(jiàn)表達(dá)。但是有關(guān)Survivin在膀胱癌患者尿液脫落細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)研究較少。本文旨在研究Survivin在膀胱癌患者尿液脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本文選取2016年9月-2018年9月在我院就診的膀胱癌患者50例，分為膀胱癌組，男28例，女22例，年齡28-65歲，平均年齡(40.5±7.6)歲，BMI(23.43±3.54) kg/m2。選取同時(shí)期在我院就診的膀胱良性病變患者20例，分為良性組，其中包括：膀胱息肉8例，膀胱腺瘤6例，膀胱乳頭狀瘤6例，男12例，女8例，年齡25-65歲，平均年齡(41.1±7.8)歲，BMI(22.96±3.57)kg/m2。選取同一時(shí)期在我院健康體檢的志愿者20例，分為正常組，男10例，女10例，年齡22-60歲，平均年齡(40.4±7.5)歲，BMI(21.73±3.14)kg/m2。三組研究對(duì)象在性別比例、平均年齡、BMI比較中，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：膀胱癌和良性病變患者均經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診；膀胱癌患者未進(jìn)行放療和化療治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：精神異常患者；肝、腎等重要器官損傷患者；妊娠期及哺乳期患者；伴有其他惡性腫瘤患者。本文研究及其家屬均知情，簽署知情通知書。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 尿液脫落細(xì)胞DNA提取：采集所有研究對(duì)象晨尿200 ml，用離心機(jī)以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速分離，時(shí)間為15 min，得到沉淀物，即尿液脫落細(xì)胞。加入1 ml PBS將沉淀物懸浮，轉(zhuǎn)移到1.5 ml的離心管中，離心處理后，摒棄上清液，加入細(xì)胞裂解液，50℃孵育2 h，加入酚/氯仿抽提2次，采用酒精沉淀后提取DNA，之后加入0.3 ml的10 mM Tris以及1 mM EDTA進(jìn)行溶解，在-20℃保持備用。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Survivin在尿液脫落細(xì)胞中的表達(dá) 將采集到的標(biāo)本，置于一次性真空無(wú)抗凝劑的采血管中，使用Ficoll液分離單個(gè)核細(xì)胞。TRIzol提取細(xì)胞RNA，經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)RNA并定量，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，探針或SYBR 反應(yīng)25 ul，反應(yīng)條件滿足：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40個(gè)循環(huán),設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)組和空白對(duì)照。將PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，調(diào)節(jié)基線，采用2-△△Ct分析尿液脫落細(xì)胞表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 所有研究對(duì)象一般臨床資料比較

如表1所示，正常組、良性組、膀胱癌組三組患者在平均年齡、BMI、性別比較中，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 兩組研究對(duì)象一般臨床資料比較

2.2 膀胱癌患者尿液脫落細(xì)胞中Survivin表達(dá)情況

如表2所示，膀胱癌組尿液脫落細(xì)胞中Survivin表達(dá)90.00%高于正常組和良性組，良性組尿液脫落細(xì)胞中Survivin表達(dá)40.00%高于正常組0.00%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組Survivin表達(dá)比較

2.3 Survivin表達(dá)與患者肌層浸潤(rùn)相關(guān)性

如表3所示，有肌層浸潤(rùn)患者Survivin表達(dá)89.29%高于無(wú)肌層浸潤(rùn)患者54.55%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 Survivin表達(dá)與患者肌層浸潤(rùn)相關(guān)性比較(%)

2.4 Survivin表達(dá)與患者T分期相關(guān)性

如表4所示，T分期≥T2期患者Survivin表達(dá)86.67%高于T分期

表4 Survivin表達(dá)與患者T分期相關(guān)性比較(%)

2.5 Survivin表達(dá)與患者不同病理分級(jí)相關(guān)性

如表5所示，病理分級(jí)G2-G3級(jí)患者Survivin表達(dá)88.89%高于病理分級(jí)G1級(jí)患者47.83%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表5 Survivin表達(dá)與患者不同病理分級(jí)相關(guān)性比較(%)

3 討論

近年來(lái)研究數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌發(fā)病率、病死率逐年升高[6]，對(duì)患者的健康產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，同時(shí)增加了患者家庭及其社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此對(duì)膀胱癌患者做到早期診斷尤為重要。目前關(guān)于膀胱癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，受多種因素影響。膀胱癌中大部分為膀胱移行細(xì)胞癌，膀胱癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后受癌細(xì)胞侵襲肌層、血管的影響，其中Survivin是腫瘤特異性凋亡抑制蛋白[7，8]，Mazoochi T[9]研究認(rèn)為，腫瘤特異性凋亡抑制蛋白在惡性腫瘤中顯示特異性表達(dá)。

尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)尿液檢測(cè)，相關(guān)研究顯示，在分化差以及高病理期的膀胱癌中，經(jīng)過(guò)尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率較高，在分化較好的膀胱癌中，經(jīng)過(guò)尿細(xì)胞學(xué)檢查檢查發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率較低，因此臨床中膀胱癌尿細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性顯示膀胱癌是侵襲性癌癥以及分化較差[10,11]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的新成員，Survivin過(guò)度表達(dá)會(huì)對(duì)細(xì)胞凋亡的內(nèi)外途徑起抑制作用。Survivin在終末分化的成人組織中不表達(dá)，在結(jié)腸癌、肺癌等惡性腫瘤中顯示過(guò)度表達(dá)[12]。臨床中主要采用RT-PCR檢測(cè)患者尿液脫落細(xì)胞中Survivin RNA，其中敏感度為64%-94%，特異度為93%-100%，敏感度和特異度較高，可作為新型的腫瘤標(biāo)記物[13]。本文研究結(jié)果顯示，膀胱癌組尿液脫落細(xì)胞中Survivin表達(dá)高于正常組和良性組，良性組尿液脫落細(xì)胞中Survivin表達(dá)高于正常組。說(shuō)明Survivin在正常人中無(wú)表達(dá)，在膀胱癌尿液脫落細(xì)胞中表達(dá)水平較高。與林禎祥[14]研究結(jié)果保持一致。

研究顯示，Survivin表達(dá)在區(qū)分原發(fā)膀胱腫瘤，評(píng)估腫瘤無(wú)復(fù)發(fā)間期的長(zhǎng)短發(fā)揮著重要作用[15,16]。長(zhǎng)無(wú)復(fù)發(fā)間期Survivin診斷率是71.4%，短無(wú)復(fù)發(fā)間期診斷率是69.6%；是評(píng)估膀胱癌臨床復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)[17]。本文研究結(jié)果顯示，有肌層浸潤(rùn)患者Survivin表達(dá)高于無(wú)肌層浸潤(rùn)患者，說(shuō)明Survivin表達(dá)與膀胱癌有無(wú)肌層浸潤(rùn)有關(guān)。Survivin表達(dá)提升與腫瘤的組織分化有關(guān)，徐海波[18]研究指出，在不同臨床分期的膀胱癌患者中發(fā)現(xiàn)，Survivin在癌組織中高表達(dá)，隨患者病情發(fā)展，Survivin表達(dá)逐漸升高，尤其是在Ⅳ期，Survivin表達(dá)最高。本文研究數(shù)據(jù)顯示，T分期≥T2期患者Survivin表達(dá)高于T分期

綜上所述，Survivin在膀胱癌患者尿液脫落細(xì)胞中顯示高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者肌層浸潤(rùn)、T分期、病理分級(jí)有關(guān)，參與膀胱癌發(fā)展。