基于斑馬魚模型的西洋參提取物心臟保護作用研究

呂婧 李晨 楊龍飛 高燕 趙渤年

中圖分類號 R285

文獻標志碼A

文章編號 1001-0408（2020）03-0308-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0q08.2020.03.11

摘要 目的：研究西洋參提取物的心臟保護作用。方法：通過耐受性實驗確定西洋參提取物的給藥劑量以及特非那定的最優(yōu)造模劑量后，將受精后24h（24hpf）的斑馬魚分為空白對照組（0.5%二甲基亞砜）、模型組（2.5μg/mL特非那定）、陽性對照組（2.5μg/mL特非那定+30μg/mL白藜蘆醇）和不同質(zhì)量濃度西洋參提取物組（2.5μg/mL特非那定+5、10、25μgmL西洋參提取物，以生藥量計）;孵育48h后，以斑馬魚心率、心臟靜脈竇一動脈球（SV-BA）間距為指標，并計算其心臟損傷修復率，以考察西洋參提取物的心臟保護作用。另取24hpf的斑馬魚分為空白對照組、模型組、陽性對照組和20批不同產(chǎn)地西洋參提取物組（5μg/mL，以生藥量計），同法給藥和孵育48h后，測定其心率、心臟SV-BA間距，并計算其心臟損傷修復率和心臟損傷相對修復率，進一步驗證西洋參提取物的心臟保護作用。結果：與空白對照組比較，模型組斑馬魚心率顯著降低（P<0.01），心臟SV-BA間距顯著增大（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和5、10、25μg/mL西洋參提取物組斑馬魚心率顯著升高（P

關鍵詞 西洋參;斑馬魚;心臟保護;靜脈竇一動脈球;間距;心率

西洋參為五加科植物西洋參（Panax quinquefoliumL.）的干燥根，其味甘、微苦，性涼，歸心、肺、腎經(jīng)n，，可補氣養(yǎng)陰[2]，常用于治療氣虛陰虧型冠心病[3-4]。相關研究表明，西洋參通過益氣養(yǎng)陰、和血來補益心氣[5]，可改善冠心病患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術后的胸悶、心悸、乏力等癥狀，提高患者生活質(zhì)量[6]。但關于西洋參是否均具有心臟保護作用尚不明確，而且目前常用的心臟功能研究動物模型造模過程操作復雜，不便于進行在體的心臟結構及功能研究，也不適宜進行高通量藥材心臟保護活性篩選。斑馬魚是國際認可的新型模式生物[7]，具有體型小、心臟發(fā)育周期全透明、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、發(fā)育迅速等優(yōu)點[8]。基于此，本研究采用特非那定復制斑馬魚心臟損傷模型[9-10]，以心臟靜脈竇一動脈球（SV-BA）間距為主要指標、心率為輔助指標探討西洋參提取物的心臟保護作用，并進一步為西洋參提取物心臟保護作用譜一效相關質(zhì)量評價系統(tǒng)的建立提供藥效學基礎。

l 材料

1.1 儀器

SPX-280B-G型光照培養(yǎng)箱（上海基星生物科技有限公司）;AGBP210S型電子天平（德國Sartorius公司）;Milli-QIQ7000型純水機（美國Millipore公司）;KDM-A型控溫電熱套（金壇市醫(yī)療儀器廠）;GZX-9140MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博訊有限公司）;KQ2200DV型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;AXIO Zoom.V16型體式顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）;FW-80型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

20批西洋參藥材購自安徽省毫州市中藥材交易市場，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定均為真品，其總皂苷含量均符合2015年版《中國藥典》（一部）[1]規(guī)定;特非那定標準品、鏈酶蛋白酶E（北京索萊寶科技有限公司，批號：607A023、515S021，純度：≥98%）;白藜蘆醇標準品（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS000122，純度：≥98%）;其他試劑均為市售分析純，水為蒸餾水。20批西洋參樣品信息見表1。

1.3 動物

野生型AB品系斑馬魚，雌雄兼有，由山東省科學院生物所提供。在專用的養(yǎng)殖房內(nèi)，斑馬魚采用明暗交替方式飼養(yǎng)（光照14h后避光10h），循環(huán)水及環(huán)境溫度控制為（28.0±0.5）℃，并按雌雄分缸飼養(yǎng)，每日飼喂豐年蝦。

2 方法與結果

2.1 西洋參提取物母液的制備

取西洋參粉末（過三號篩）lg，精密稱定，置于具塞圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇50mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2h，放冷，再次稱質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25mL，蒸干。干燥提取物以二甲基亞砜（DMSO）溶解，制成質(zhì)量濃度為50mg/mL（以生藥量計）的西洋參提取物母液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＝o藥前，取適量母液用蒸餾水稀釋為所需質(zhì)量濃度。

2.2 斑馬魚胚胎的收集

實驗前將斑馬魚按雌雄比例1：1或1：2放置于產(chǎn)卵缸中，采用隔板將雌雄斑馬魚隔開，次日光照前抽離隔板，使雌雄斑馬魚自由受精。于抽離隔板時計時為0hpf（Hours post fertilization，受精后時間），抽離隔板后2h（2hpf）收集受精卵，置于清潔培養(yǎng)液中滴加適量亞甲基藍溶液，放置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中孵育至24hpf。

2.3 斑馬魚對西洋參提取物的耐受性考察

將發(fā)育至24hpf的斑馬魚受精卵用1mg/mL的脫膜劑鏈酶蛋門酶E脫膜處理，體式顯微鏡下篩選發(fā)育正常的幼魚，然后置于24孔板中，每孔10條。將實驗分為不同質(zhì)量濃度西洋參提取物組（1、5、10、25、50、100、200、400、800μg/mL，以生藥量計）和空門對照組（0.5%DMSO），每組平行2孔（即每組20條斑馬魚樣本）。加蓋后將斑馬魚置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中孵育，每隔24h更換1次新鮮藥液或DMSO。記錄給藥48h后斑馬魚幼魚的死亡情況，計算其死亡率，并采用SPSS 23.O統(tǒng)計軟件通過回歸分析計算西洋參提取物的最低致死質(zhì)量濃度，考察斑馬魚對西洋參提取物的耐受性。斑馬魚對西洋參提取物的耐受性考察結果見圖1。

由圖1可知，當西洋參提取物質(zhì)量濃度≤50μg/mL時，斑馬魚幼魚死亡率均為O;當西洋參提取物質(zhì)量濃度≥100μg/mL時，斑馬魚幼魚死亡率隨著西洋參提取物質(zhì)量濃度的增加而升高。回歸分析結果顯示，西洋參提取物的最低致死質(zhì)量濃度為44.18μg/mL。為了保證實驗過程中斑馬魚的正常存量，故將西洋參提取物的給藥質(zhì)量濃度設為5、10、25μg/mL（以生藥量計）進行后續(xù)心臟保護作用研究。

2.4 特非那定對斑馬魚心臟形態(tài)的影響考察

將發(fā)育至24hpf的斑馬魚受精卵用1mg/mL鏈酶蛋門酶E脫膜后，體式顯微鏡下篩選發(fā)育正常的幼魚，然后隨機置于24孔板中，每孔10條。將實驗分為不同質(zhì)量濃度特非那定組（2、2.5、3、4μg/mL）和空門對照組（0.5% DMSO），每組平行2孔（即每組20條斑馬魚樣本）。加蓋后將斑馬魚置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中孵育48 h后，采用體式顯微鏡觀察斑馬魚心臟部位的形態(tài)變化。采用Image Pro-plus 5.O軟件測量斑馬魚心臟SV-BA間距，錄像20s觀察其心臟律動及血流情況，以此來篩選特非那定最優(yōu)心臟損傷造模劑量。在每組20條斑馬魚樣本中剔除死亡、畸形以及數(shù)據(jù)異常的斑馬魚樣本，以每組11條斑馬魚為統(tǒng)計學分析樣本量（n=ll），采用SPSS 23.O軟件進行單因素方差分析和t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。不同質(zhì)量濃度特非那定對斑馬魚心臟損傷情況觀察結果見圖2，對斑馬魚心臟SV-BA間距的影響結果見表2。

結果顯示，特非那定給藥后引起了斑馬魚心臟損傷，包括心包水腫、血細胞在心房心室堆積、卵黃囊下出現(xiàn)明顯淤血、心房心室律動不齊、血流速度減慢等現(xiàn)象，各質(zhì)量濃度特非那定組斑馬魚心臟SV-BA間距均較空白對照組顯著增大（P<0.05），并且以2.5μg/mL特非那定組最為明顯，故最終選擇特非那定的造模劑量為2.5μg/mL。

2.5 西洋參提取物對斑馬魚的心臟保護作用考察

將發(fā)育至24hpf的斑馬魚受精卵用1mg/mL鏈酶蛋白酶E脫膜后，體式顯微鏡下篩選發(fā)育正常的幼魚，然后隨機置于24孔板中，每孔10條。將實驗分為空門對照組（0.5% DMSO）、模型組、陽性對照組（門藜蘆醇30μg/mL）[10-11]和西洋參提取物組（樣品批號：20180185，10、25μg/mL，以生藥量計），每組平行2孔（即每組20條斑馬魚樣本）。除空門對照組外，其余各組均按“2.4”項下方法添加2.5μg/mL特非那定，加蓋后將斑馬魚置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中孵育48h后，采用體式顯微鏡觀察斑馬魚心臟部位的形態(tài)變化，錄像20s觀察其心臟律動及血流情況。采用Image Pro-plus 5.O軟件測量斑馬魚SV-BA間距，并對錄像中斑馬魚心跳進行計數(shù)以推算其心率，同時計算斑馬魚心臟損傷修復率[心臟損傷修復率（%）=（給藥組斑馬魚心臟SV-BA間距-模型組斑馬魚心臟SV-BA間距）/（空白對照組斑馬魚SV-BA間距一模型組斑馬魚SV-BA間距）Xl00%]。統(tǒng)計分析方法同“2.4”項下。各組斑馬魚心臟損傷情況觀察結果見圖3，心率測定結果見表3，心臟SV-BA間距、心臟損傷修復率測定結果見表4。

結果顯示，模型組斑馬魚出現(xiàn)了明顯的心臟損傷癥狀，表現(xiàn)為心包水腫、卵黃囊下淤血、心房心室律動不齊、血流速度減慢等;陽性對照組及西洋參提取物各給藥組斑馬魚心包水腫和卵黃囊下淤血減輕，心房心室律動趨近整齊，血流速度恢復正常。與空白對照組比較，模型組斑馬魚心率顯著降低（P<0.01），心臟SV-BA間距顯著增大（P<0.01），說明特非那定造成了斑馬魚心臟損傷。與模型組比較，陽性對照組和5、10、25μg/mL西洋參提取物組斑馬魚心率顯著升高（P<0.01），陽性對照組和5、10μg/mL西洋參提取物組斑馬魚心臟SV-BA間距顯著縮短（P<0.05或P

2.6 20批不同產(chǎn)地西洋參提取物對特非那定所致斑馬魚心臟損傷的保護作用考察

將發(fā)育至24hpf的斑馬魚受精卵用1mg/mL鏈酶蛋門酶E脫膜后，在體式顯微鏡下篩選發(fā)育正常的幼魚，然后隨機置于24孔板中，每孔10條。將實驗分為空白對照組（0.5% DMSO）、模型組、陽性對照組和20批不同產(chǎn)地西洋參提取物組（質(zhì)量濃度均為5μg/mL，以生藥量計），每組設2個復孔（即每組20條斑馬魚樣本）。除空白對照組外，其余各組均按“2.5”項下方法加入2.5μg/mL特非那定孵育和相應指標檢測及統(tǒng)計分析外，同時計算西洋參提取物組較陽性對照組的心臟損傷相對修復率[心臟損傷相對修復率（%）=西洋參提取物組斑馬魚心臟損傷修復率/陽性對照組斑馬魚心臟損傷修復率×100%]。驗證實驗中各組斑馬魚心率、心臟SV-BA間距、心臟損傷修復率及心臟損傷相對修復率測定結果見表5（圖略）。

結果顯示，模型組斑魚表現(xiàn)出了上述心臟損傷癥狀;陽性對照組和20批不同產(chǎn)地西洋參提取物組斑馬魚以上癥狀均明顯減輕甚至恢復正常。與空白對照組比較，模型組斑馬魚心率顯著降低，心臟SV-BA間距顯著增大（P<0.01），說明特非那定造成了斑馬魚心臟損傷。與模型組比較，陽性對照組和20批西洋參提取物組斑馬魚心率均顯著升高，心臟SV-BA間距均顯著縮短（P<0.01）。通過分析20批西洋參提取物組心臟損傷相對修復率數(shù)值可知，由于西洋參的產(chǎn)地及批次不同，所以20批西洋參提取物對斑馬魚心率及心臟SV-BA間距改善作用略有不同，但心臟損傷相對修復率在75.48%～98.12%之間，說明各產(chǎn)地的西洋參提取物均具有一定的心臟保護作用。其中，以批號為2018006的西洋參提取物的心臟保護作用最優(yōu)，其心臟損傷相對修復率達98.12%。

3 討論

斑馬魚心臟靜脈竇是血液進入心房的部位，動脈球是血液流出心室的部位，心臟SV-BA間距最能反映其心臟損傷程度;另外，斑馬魚的心率反映了心臟的泵血功能[11-12]。所以，本研究選用斑馬魚心臟SV-BA間距為主要指標、心率為輔助指標，考察西洋參提取物對斑馬魚心臟損傷的保護作用。

研究顯示，目前具有明確的心臟保護作用或常用于治療由毒副反應引起的心臟損傷的藥物有右丙亞胺、復方丹參滴丸、白藜蘆醇等[13]。其中，右丙亞胺作為美國FDA的批準藥物，因價格昂貴，極大地限制了其應用。白藜蘆醇作為一種抗氧化劑[14]，對冠心病、缺血性心臟病具有防治作用[15-16];尤其在斑馬魚心臟損傷/保護的研究領域中，考慮到斑馬魚獨特的透皮吸收給藥方式，白藜蘆醇常用作斑馬魚心臟保護藥來改善毒副反應引發(fā)的心臟損傷[17]。由于復方丹參滴丸獨特的質(zhì)地不適于斑馬魚給藥，所以在前期研究中，筆者比較了丹參原藥材、含有丹參提取物的丹紅注射液以及白藜蘆醇對斑馬魚的心臟保護作用。結果發(fā)現(xiàn)丹參及丹紅注射液主要通過促進斑馬魚血管生成、擴張血管等作用減輕心臟損傷;而白藜蘆醇可改善斑馬魚心臟SV-BA間距、心率及血流情況，具有直接的心臟保護作用，并且其心臟保護的作用途徑與西洋參提取物類似，這更有利于作為對照物研究西洋參提取物心臟保護作用機制和作用靶點，故本研究最終選擇白藜蘆醇作為陽性對照藥。

在本研究中，2.5μg/mL的特非那定可明顯造成斑馬魚心臟損傷。陽性對照藥白藜蘆醇和5、10、25μg/mL的西洋參提取物作用后，斑馬魚心臟損傷情況均不同程度地改善，其心包水腫和卵黃囊下淤血減輕、血流速度恢復正常、心臟SV-BA間距顯著縮短、心率顯著升高，并且以5μg/mL西洋參提取物作用后效果最為明顯（心臟損傷修復率為73.77%）。在驗證實驗中，由于用于實驗研究的西洋參產(chǎn)地、批次較多，不可能通過1次實驗就完成驗證，而每次實驗用于配對產(chǎn)卵的斑馬魚存在個體差異，這導致了所產(chǎn)的魚卵狀態(tài)不同，對同一質(zhì)量濃度的同一種藥物反應也不同，故心臟SV-BA間距及心率測量值也會有一定差異。所以為了減少斑馬魚個體誤差及操作誤差，在參考相關文獻[10-11]后，針對多批次西洋參提取物心臟保護作用的評價，本研究以每次實驗中陽性對照組斑馬魚心臟損傷修復率作為參比，計算心臟損傷相對修復率作為西洋參提取物心臟保護藥效評價指標，實現(xiàn)高通量藥材藥效評價的目的。本研究結果顯示，20批西洋參提取物（5μg/mL，以生藥量計）對斑馬魚的心臟損傷相對修復率在75.48%～98.12%之間，提示其均具有一定的心臟保護作用。

綜上所述，本研究利用斑馬魚模型，以心臟SV-BA間距為主要指標、心率為輔助指標，證實了西洋參提取物具有一定的心臟保護作用，且方法穩(wěn)定、結果可靠。但是西洋提取物心臟保護的藥效物質(zhì)基礎及西洋參提取物心臟保護作用的譜一效關系還有待進一步研究。

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（收稿日期：2019-09-25修回日期：2019-11-17）

（編輯：林靜）