櫻桃果酒釀酒酵母的篩選及香氣成分分析

王軒，周健，明紅梅，彭璐，趙炳鑫，俞飛

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢，643000)

櫻桃屬薔薇目薔薇科櫻桃屬的落葉喬木，因在落葉果樹中成熟期較早，有“春果第一枝”的美譽[1]。由于櫻桃屬于不耐貯運易腐爛變質(zhì)的水果[2]，因此各地對種植櫻桃持謹慎態(tài)度，影響櫻桃產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。目前研究表明：櫻桃富含花青素、黃酮、褪黑激素等生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗氧化、消炎、鎮(zhèn)痛等作用[3]。而櫻桃果酒開發(fā)既符合糧食酒向果酒轉(zhuǎn)變的行業(yè)政策[4]，同時又賦予果酒保健的功效，具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

目前，市面上櫻桃酒產(chǎn)品多采用葡萄酒酵母發(fā)酵而成，產(chǎn)品存在特征香氣不夠明顯、果香不夠濃郁、口感較差等問題[5]。而現(xiàn)階段對于櫻桃果酒研究集中在2個方面：1.對櫻桃果酒發(fā)酵工藝研究。如李志友等[1]、范兆軍等[6]通過優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，得到酒精度在10%vol～11%vol的櫻桃果酒。2.對櫻桃果酒香氣成分研究。如秦偉帥等[7]、于海燕等[8]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace solid phase micro-extraction combine with gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS)技術(shù)對櫻桃果酒中香氣成分檢測，結(jié)果表明辛酸乙酯、異戊醇、苯甲醛等在櫻桃酒中含量較高，是櫻桃酒特征香氣物質(zhì)。但針對篩選適合櫻桃果酒釀造優(yōu)良酵母的報道較少[9]。在果酒釀造中，酵母性能的好壞直接影響果酒的風味和口感，決定果酒質(zhì)量[10]。現(xiàn)階段櫻桃果酒酵母篩選還處于初級階段，篩選出適合櫻桃果酒釀造的優(yōu)良酵母尤為重要。

本次研究對酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力和耐受性進行篩選，結(jié)合細胞形態(tài)和分子生物學鑒定，并對發(fā)酵櫻桃果酒香氣成分及香氣活度值(odor activity value, OAV)分析。以期篩選出適合櫻桃果酒的優(yōu)良釀酒酵母，為櫻桃果酒釀造提供寶貴的菌株資源，從而提高櫻桃果酒品質(zhì)，為果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

櫻桃、自然腐敗櫻桃，品種為“美早”，購自零售市場；果園土壤，內(nèi)江市慶衛(wèi)鎮(zhèn)櫻桃種植基地。白砂糖，市售。F15:市售商業(yè)釀酒酵母(簡稱F15)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

葡萄糖、NaOH、偏重亞硫酸鉀等均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)為分析純，上海靈錦精細化工有限公司；2-辛醇為色譜純,成都艾科達化學試劑有限公司;孟加拉紅培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;YPD液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、TTC培養(yǎng)基參考文獻[11]。

1.3 儀器與設(shè)備

恒溫搖床(SKY-2102C)、培養(yǎng)箱(GZ-250-M)，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；pH計(STO210)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；固相微萃取頭(50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS)、手動SPME進樣器，美國Supelco公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agligent 6890N-5975B)，美國安捷倫公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 酵母菌富集與分離純化

將新鮮櫻桃、腐敗櫻桃、土壤樣品分別加入無菌水制成菌懸液。將菌懸液加入YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min富集培養(yǎng)24 h。典型的酵母菌落表面光滑、濕潤、黏稠，質(zhì)地柔軟，易挑起，多為乳白或奶油色，具有愉悅香氣等特征[12]。取富集液稀釋涂布于孟加拉紅分離培養(yǎng)基，根據(jù)上述特征來觀察和聞香挑選具有典型酵母特征和愉悅香氣的酵母，在YPD固體培養(yǎng)基斜面上4 ℃保藏。

1.4.2 酵母菌初篩

TTC是一種顯色劑，它能對酵母中脫氫酶發(fā)生呈色反應(yīng)，通過顏色深淺可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即初步判斷酵母產(chǎn)酒精能力的高低，產(chǎn)酒精能力強的酵母會顯深紅色，次之顯紅色、微紅色或不顯[13]，將1.4.1中酵母活化得到的菌懸液，稀釋涂布于TTC下層平板，倒置培養(yǎng)，選取菌落數(shù)在50～100個的平板倒入TTC上層培養(yǎng)基覆蓋原有菌落，避光培養(yǎng)，最后挑選顏色深紅的菌株作為初篩菌株。

1.4.3 酵母菌復篩

采用果汁發(fā)酵法對初篩酵母進行復篩[14]，櫻桃發(fā)酵液中櫻桃汁含量為35%(體積分數(shù))，調(diào)整外觀糖度到25°Bx，SO2含量為80 mg/L(以偏重亞硫酸鉀形式添加)，酵母接種量為105個/mL發(fā)酵液，發(fā)酵溫度28 ℃。以總糖含量小于4 g/L時為發(fā)酵終點，發(fā)酵結(jié)束后測其理化指標：酒精度、總酸、總酯和感官評價，最終篩選出發(fā)酵果酒酒精度高、酸度適中、感官評分高的酵母為復篩目的菌株，以F15作對照。

櫻桃酒理化指標中總酯參考胡志平等[15]方法；酒精度、總酸參考GB/T 15038—2006[16]。感官評分標準參考賈瑞楠等[17]的方法并稍作調(diào)整，見表1所示。

表1 櫻桃果酒感官評分標準Table 1 Cherry fruit wine sensory scoring standard

1.4.4 酵母菌耐受性實驗

將目的酵母菌按表2條件進行耐受性研究。將酵母菌以107個/mL接種于裝有YPD液體培養(yǎng)基試管中，28 ℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h觀察杜氏小管內(nèi)產(chǎn)氣情況，以F15作對照。

表2 酵母菌耐受性試驗條件及梯度Table 1 Test yeast tolerance test conditions and gradients

注：“-”表示未設(shè)置條件梯度

1.4.5 酵母菌形態(tài)學觀察及分子生物學鑒定

將酵母菌接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上劃線，觀察酵母菌落形態(tài)；用水浸法制片于顯微鏡下觀察酵母細胞形態(tài)和出芽情況。同時將目的酵母活化后送至上海生工進行測序，將測序結(jié)果于NCBI進行BLAST分析，用MEGA6構(gòu)建菌株發(fā)育樹。

1.4.6 櫻桃果酒香氣成分及OAV分析

將復篩目的酵母按105個/mL接種于1.4.3發(fā)酵液中，發(fā)酵結(jié)束后對其香氣成分測定及OAV分析，以F15發(fā)酵試驗作對照。

1.4.6.1 香氣成分分析

運用HS-SPME/GC-MS對櫻桃果酒進行測定。取櫻桃果酒5 mL，2 g NaCl于15 mL頂空瓶內(nèi)，50 ℃平衡15 min，萃取30 min。萃取完成后將固相微萃取頭插入解析口，解析5 min，進行GC-MS分析，以2-辛醇為內(nèi)標進行半定量分析，升溫程序參考于海燕等[8]的方法。

1.4.6.2 香氣活度值分析

根據(jù)1.4.6.1櫻桃果酒所含香氣物質(zhì)基礎(chǔ)上，查閱香氣物質(zhì)在體積分數(shù)9.5%～14%乙醇水溶液中的閾值，根據(jù)閾值和含量計算出香氣物質(zhì)的OAV值，計算方式參考李凱等[13]的方法。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0軟件來進行統(tǒng)計和方差分析，顯著性界值P<0.05，從而判斷數(shù)據(jù)差異；數(shù)據(jù)圖采用Origin繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離純化

通過菌落形態(tài)和細胞鏡檢觀察，從樣本中分離純化出35株酵母菌，編號J1-J35。將35株酵母稀釋涂布到TTC平板，從中篩選出8株顯色深紅的菌株作為初篩菌株，由圖1可知不同酵母顯色不一樣。

a-不顯色酵母;b-顯深紅色酵母圖1 酵母染色對比圖Fig.1 Yeast staining comparison chart

2.2 酵母菌復篩

將初篩出的8株酵母與F15進行果酒發(fā)酵，待發(fā)酵結(jié)束后測其理化指標并進行感官評定，由圖2可知，復篩酵母中J35發(fā)酵櫻桃果酒酒精度與總酯含量最高，分別為12.57%vol和5.55 g/L，與F15果酒差異顯著。根據(jù)行業(yè)標準要求果酒中總酸含量應(yīng)在4～9 g/L[18]，J35發(fā)酵櫻桃果酒總酸含量適中，為5.46 g/L，與F15果酒差異不顯著。在櫻桃果酒感官評定中，J35果酒得分最高，與F15果酒相比，兩者差異顯著，其中J35櫻桃果酒色澤深紅、果香濃郁、酯香突出、口感醇厚、典型性強。產(chǎn)酒精能力的強弱是評價果酒酵母性能的一個重要指標[11]。櫻桃果酒中有機酸主要為蘋果酸和檸檬酸，有機酸含量過高會給人酸澀、粗糙的感覺[19]，酒中酸度適當、比例協(xié)調(diào)，可以使酒呈現(xiàn)回甜感[20]。因此，復篩選擇發(fā)酵櫻桃果酒酒精度高、總酯含量高、酸度適中、感官評分高的J35作為復篩目的菌株。

2.3 菌株耐受性

比較酵母菌在不同糖濃度、pH、酒精度、SO2添加量下杜氏小管中產(chǎn)氣情況，在相同時間內(nèi)產(chǎn)氣更多則耐受能力更強，從而反應(yīng)出酵母能夠適應(yīng)的發(fā)酵環(huán)境，結(jié)果如表3所示。

a-酒精度;b-總酸;c-總酯；d-感官評分圖2 櫻桃果酒理化指標及感官評分Fig.2 Physical and chemical indicators and sensory scores of cherry fruit wine注：不同字母表示差異性顯著(P<0.05)

表3 不同條件梯度下酵母產(chǎn)氣情況Table 3 Yeast gas production under different gradients

注:“+”為12 h產(chǎn)氣充滿杜氏小管；“++”為24 h產(chǎn)氣充滿杜氏小管；“+++”為36 h產(chǎn)氣充滿杜氏小管；“++++”為48 h充滿杜氏小管，“-”為不產(chǎn)氣。序號1～6的實驗條件同表2中的序號1～6

果酒釀造中，糖作為酵母生長代謝所需要的碳源，但糖濃度過高會提高酵母滲透壓從而抑制其生命活動[21]。由表3可以看出，當糖濃度在45°Bx時候，J35能在48 h內(nèi)產(chǎn)氣充滿杜氏小管，而F15不再產(chǎn)氣，說明J35糖耐受性較強。pH過低會影響酵母的生長及代謝[11]，J35在pH為2時能在36 h產(chǎn)氣充滿杜氏小管，而F15在pH為2時不產(chǎn)氣，因此J35具有較好的低pH耐受性。酒精是酵母的代謝產(chǎn)物之一，但濃度過高會對自身有毒害作用[21]。當酒精濃度為18%vol時，J35能在48 h產(chǎn)氣充滿杜氏小管，而F15不產(chǎn)氣，因此J35耐酒精能力較強。在果酒釀造時會添加一定量的SO2來抑制雜菌生長繁殖，GB 2760—2014[22]中SO2最大添加量為250 mg/L。J35和F15均能在250 mg/L條件下產(chǎn)氣充滿杜氏小管，但J35產(chǎn)氣速率更快，因此J35對SO2耐受性較強。

2.4 菌株形態(tài)觀察及分子生物學鑒定

將J35置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結(jié)果如圖3所示，并將測序結(jié)果在NCBI進行比對，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。

由圖3可見，酵母菌J35經(jīng)培養(yǎng)24 h后菌落呈乳白色、濕潤、表面光滑、菌落中間隆起邊緣光滑。酵母菌J35在光學顯微鏡下觀察細胞橢圓形，單端出芽。將J35測序結(jié)果與NCBI中GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中酵母模式菌株基因序列進行比對，選取相似度高的模式菌株序列，運用Mega軟件中Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖4可見，與釀酒酵母相似度高達98%，初步確定J35為釀酒酵母。

圖3 酵母J35菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.3 Yeast J35 colony morphology and microscopicmorphology

圖4 J35系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 J35 phylogenetic tree

2.5 櫻桃果酒香氣成分及香氣活度值分析

2.5.1 櫻桃果酒香氣成分分析

將復篩目的菌株J35與F15發(fā)酵得到的櫻桃果酒采用HS-SPME/GC-MS進行香氣成分分析，其結(jié)果見表4。2種櫻桃酒共檢測出38種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)17種、醇類物質(zhì)13種、酸類物質(zhì)2種、酮醛類物質(zhì)3種、萜烯類物質(zhì)2種、其他1種。

2.5.1.1 酯類化合物比較分析

香氣成分是評價果酒品質(zhì)的重要指標之一，其中酯類物質(zhì)既呈香也呈味，是酒類中重要的風味化合物[23]。從表4可以看出2種櫻桃果酒中主要酯類為癸酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯等，這些物質(zhì)也是櫻桃酒重要酯類物質(zhì)[7]，酯類物質(zhì)中癸酸乙酯和辛酸乙酯所占比例較高，其中J35果酒中這2種物質(zhì)是F15的1.59和1.49倍。在果酒中，酯類物質(zhì)一部分來源于果實本身，一部分來源于發(fā)酵過程中醇與酸的酯化反應(yīng)。由文獻[8,24]可知櫻桃果實中含有一定量的癸酸乙酯、辛酸乙酯等物質(zhì)，隨著發(fā)酵過程的進行，其含量明顯增加。

表4 櫻桃果酒香氣成分表Table 4 Cherry fruit wine aroma ingredients table

續(xù)表4

序號化合物香氣描述J35/(ug·L-1)F15/(ug·L-1)303-吲哚乙醇--89.86±10.76酸類31乙酸醋酸味324.26±49.40a171.85±32.05b32辛酸奶酪香、脂肪臭715.81±32.03a373.41±28.29b酮醛類333-羥基-2-丁酮水果香、霉腐味和木香64.21±8.34a75.13±6.92a342-壬酮水果香、花香、油脂香、藥香15.64±3.49-35苯甲醛櫻桃果香、杏仁香、花香2 724.46±188.32a43.91±6.00b萜烯類36β-香茅醇青香、花香玫瑰香157.78±14.92a115.88±19.53b37α-松油醇海桐花香、紫丁香、鈴蘭香-19.87±3.24其他382,4-二叔丁基酚石炭酸味202.21±17.48a120.87±10.43b

注：“-”為未檢測出；同行不同字母表示差異性顯著(P<0.05)

2.5.1.2 醇類化合物比較分析

醇類物質(zhì)是酵母在酒精發(fā)酵過程中利用氨基酸或糖代謝產(chǎn)生的次級產(chǎn)物，構(gòu)成酒類的主體香氣成分[25]。2種發(fā)酵櫻桃果酒的醇類物質(zhì)中異戊醇、苯乙醇、異丁醇含量較高，并且J35果酒這些物質(zhì)是F15果酒的3.35、4.16、2.14倍。在本次研究中異戊醇是含量最高的醇類物質(zhì)，這與文獻報道較一致[26]，同時它也被認為是葡萄酒中重要的物質(zhì)[27]。櫻桃酒中的某些醇類已在櫻桃果實中被鑒定出來，如苯乙醇、異戊醇等，隨著發(fā)酵進行，這些醇類在櫻桃果酒中含量明顯增加[8]。

2.5.1.3 酸類化合物比較分析

酸類物質(zhì)是構(gòu)成櫻桃酒香氣特征重要的貢獻者[4]。本次發(fā)酵得到的櫻桃果酒中檢測出乙酸和辛酸，J35果酒的這2種物質(zhì)是F15果酒的1.89、1.92倍，其中含量最大的是辛酸，這與于海燕等[8]的報道較一致。

2.5.1.4 酮醛類、萜烯類合物比較分析

櫻桃果酒中還檢測出酮醛、萜烯類物質(zhì)。這些物質(zhì)也賦予櫻桃酒特殊香氣，其中苯甲醛在J35發(fā)酵櫻桃果酒酮醛類物質(zhì)中含量最高，它也被報道是櫻桃酒的主要香氣成分，使櫻桃酒具有特殊的苦杏仁氣息、焦糖氣味[28]。

通過上述分析，2種酵母發(fā)酵櫻桃果酒在香氣成分含量有較大差異。FRAILE[29]認為葡萄酒中香氣成分含量由發(fā)酵過程中起主導作用的酵母決定。因此，這些香氣物質(zhì)的含量差異可能是酵母不同導致。

2.5.2 香氣活度值分析

為了進一步說明各香氣成分對櫻桃果酒品質(zhì)的影響，對這些物質(zhì)的OAV值進行計算，通常認為化合物OAV值>1時，對整體香氣貢獻大[30]。化合物濃度高低不能說明對櫻桃酒的整體香氣有影響，這主要取決于化合物的閾值，如β-香茅醇含量低，但閾值低，OAV值>1，對櫻桃果酒香氣也有一定貢獻。由表5可知，本次研究J35發(fā)酵櫻桃果酒中的OAV值>1的風味化合物有癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、苯乙醇、苯甲醛、辛酸、β-香茅醇，這些物質(zhì)也是文獻[4,28,31-32] 中報道的櫻桃果酒典型香氣物質(zhì)。綜合表4與表5，比較J35與F15櫻桃果酒中典型香氣物質(zhì)，J35所含櫻桃酒典型香氣物質(zhì)種類更多且含量較為豐富，結(jié)合感官評價結(jié)果，其果香濃郁、酯香突出、富有櫻桃酒典型性風格，因此J35酵母菌可進一步開發(fā)為櫻桃酒釀造專用酵母。

表5 J35與F15發(fā)酵櫻桃果酒中OAV>1的香氣物質(zhì)Table 5 Aroma substances of OAV>1 in J35 and F15fermented cherry fruit wine

注：“-”表示未檢測出

3 結(jié)論

1株優(yōu)良果酒釀酒酵母應(yīng)具備良好的發(fā)酵性能，耐受性強，發(fā)酵產(chǎn)品香氣豐富協(xié)調(diào)[17]。本次研究從櫻桃及土壤中運用TTC顯色法初篩、果汁發(fā)酵法復篩出1株在含糖量為25°Bx、果汁含量35%條件下，產(chǎn)酒精能力為12.57%vol、酸度適中、發(fā)酵后香氣馥郁、口感較佳的優(yōu)良酵母。通過耐受性實驗表明，J35在含糖量為45°Bx、pH 2.0、酒精含量18%vol、250 mg/L SO2條件下具有良好發(fā)酵能力。J35櫻桃酒經(jīng)香氣成分與OAV分析顯示，果酒含有辛酸乙酯、癸酸乙酯、異戊醇、苯乙醇、苯甲醛、辛酸、β-香茅醇等櫻桃酒典型香味成分并且含量較為豐富。但是J35發(fā)酵櫻桃果酒與文獻報道的香氣物質(zhì)種類及含量有一定差異，這可能是果實種類及菌株不同導致，有研究表明[10,31]，酵母菌類型及發(fā)酵介質(zhì)的組成對酒中香氣成分有很大影響。后續(xù)還需針對櫻桃品種選擇、發(fā)酵條件及后處理工藝進行優(yōu)化，進一步發(fā)掘J35的潛力和應(yīng)用價值，開發(fā)成為適合櫻桃酒釀造的專用酵母，從而為櫻桃果酒產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。