超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化特性的影響

康夢(mèng)瑤，丁景，魯小川，李懿璇，尚永彪,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715)3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

豬肝是生豬屠宰的主要副產(chǎn)品之一，其蛋白含量豐富且脂質(zhì)含量甚少，必需氨基酸占比高，不僅可以改善營(yíng)養(yǎng)性貧血，還能調(diào)節(jié)和改善正常機(jī)體血液系統(tǒng)，其食療效果是其他肉類產(chǎn)品無法替代的[1-2]。但由于豬肝腥味重、味苦、切片性差和易褐變等特點(diǎn)使得其在食品工業(yè)中沒有得到合理的利用[3]。目前國(guó)內(nèi)外研究對(duì)大豆蛋白、乳清蛋白等乳化特性及其改性方法研究較多，對(duì)豬肝蛋白的研究相對(duì)較少，且主要集中在產(chǎn)品研發(fā)[4-5]和活性成分研究[6-7]上。豬肝蛋白中水溶性蛋白不僅含量多，而且具有良好的乳化性，商業(yè)利用和開發(fā)價(jià)值較高，但關(guān)于水溶性豬肝蛋白乳化特性缺乏較為系統(tǒng)的研究。

超聲波作為常用的物理處理手段，具有效率高、成本低、安全性能好等優(yōu)勢(shì)[8]，且有研究表明超聲波能通過改變蛋白質(zhì)的次級(jí)結(jié)構(gòu)而改善其功能性質(zhì)[9]。HU等[10]發(fā)現(xiàn)超聲波能通過改變肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)而改善魷魚的嫩度。NAZARI等[11]發(fā)現(xiàn)超聲處理可有效改善小米濃縮蛋白的乳化性質(zhì)。本文以新鮮豬肝為原料，提取水溶性蛋白經(jīng)超聲波處理后，考察相關(guān)功能性質(zhì)指標(biāo)的變化、探討其變化的機(jī)理，為豬肝的開發(fā)利用和水溶性豬肝蛋白在乳化型肉制品中的應(yīng)用及豬肝資源的深度開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肝(豬屠宰后3 h內(nèi))，北碚天生農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，裝在冰鮮保鮮盒中在20 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，去除脂肪和結(jié)締組織，絞碎后置于小燒杯中，保鮮膜封口后于4 ℃貯藏備用，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-10高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；XHF-D 內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZEN 3690 馬爾文激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器公司；FD-1-50 真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Power Pac Basic 小型垂直電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；722-P可見分光光度計(jì)，上海現(xiàn)科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性豬肝蛋白的提取

參照NUCKLES等[12]和LISELOT等[13]的方法并修改。取一定量的碎豬肝加入4倍體積0.05 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.4)，高速勻漿60 s充分混勻，離心(9 327×g，30 min)后取上清液，沉淀繼續(xù)上述操作3次，將所有上清液用透析袋透析脫鹽，凍干后備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取一定量的水溶性豬肝蛋白粉，用磷酸鹽緩沖溶液配制成2.5 mg/mL 的蛋白溶液，將試樣分別在0(對(duì)照組)、300、360、420、480、540 W條件下超聲波處理7 min，然后進(jìn)行乳化特性及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定；將試樣在420 W超聲處理4、7、10、13、16 min，然后進(jìn)行乳化特性及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.3 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照AGYARE等[14]和PEARCE等[15]的方法并修改。取2.0 mL大豆油和6.0 mL上述蛋白溶液于25 mL塑料離心管中，高速勻漿30 s，立即從距管底5 mm處取乳化液50 μL，加入5 mL 0.1% SDS溶液中，混勻后放置10 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在500 nm處的吸光值A(chǔ)0。勻漿液靜置10 min后，按照上述同樣方法測(cè)定其吸光值A(chǔ)10，空白用0.1% SDS溶液代替，按公式(1)、(2)計(jì)算其乳化活性(emulsifying activity,EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsification stability)。

(1)

(2)

式中：φ,油相體積分?jǐn)?shù)(油的體積/乳化體系的體積);ρ,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/L;A0、A10,乳化液在0、10 min時(shí)的吸光值;稀釋倍數(shù),101。

1.3.4 乳析指數(shù)的測(cè)定

參照SOLEIMANPOUR等[19]方法測(cè)定。

1.3.5 表面張力的測(cè)定

在25 ℃條件下用表面張力儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 乳液液滴粒徑大小及分布的測(cè)定

參照崔珊珊[17]的方法測(cè)定，用水作為分散劑。

1.3.7 蛋白吸附量的測(cè)定

參考PALAZOLO等[18]的方法并修改。按1.3.2將乳液配制好后立即倒入50 mL離心管中，室溫離心(10 000×g)30 min。取上清液測(cè)定其蛋白濃度，按公式(3)計(jì)算其蛋白吸附量。

(3)

式中：C2,蛋白溶液的濃度；C1,乳液離心后清液中的蛋白濃度；C0,蛋白溶液經(jīng)相同條件離心后上清液中的蛋白濃度。

1.3.8 界面蛋白組成的測(cè)定

參照XIONG等[19]的方法測(cè)定，取1.3.7中離心分離出的蛋白溶液進(jìn)行電泳樣品的制備。

1.3.9 乳化液的光學(xué)顯微鏡觀察

從均質(zhì)的乳化體系(水溶液豬肝蛋白-大豆油)底部取10 μL乳液滴在載玻片上，用蓋玻片蓋緊后，置于光學(xué)顯微鏡下，在10倍目鏡、40倍物鏡的視野條件下觀察并拍照。

1.3.10 乳化液分子作用力的測(cè)定

參照MONTERO等[20]并修改。稱取1.0 g乳化樣品，分別加入10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)；0.6 mol/L NaCl(SB)；0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)；0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)；0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巰基乙醇(SE)。均質(zhì)后4 ℃靜止1 h，離心(7 100×g，4 ℃，15 min)后用雙縮脲法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量來確定非特異性交聯(lián)(溶于試劑A的蛋白)，離子鍵(溶于試劑B的蛋白)，氫鍵(溶于試劑C的蛋白)，疏水相互作用力(溶于試劑D的蛋白)，二硫鍵(溶于試劑E的蛋白)。結(jié)果以1 L均質(zhì)液中可溶解的蛋白質(zhì)質(zhì)量表示(g)。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)3次，用Excel處理數(shù)據(jù)，SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Origin 8.5繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化特性的影響

2.1.1 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

超聲波功率對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖1所示，隨著超聲波功率的升高，水溶性豬肝蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性變化趨勢(shì)是一致的，均呈先增加后減小的趨勢(shì)。對(duì)照組的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最小，分別為31.41 m2/g和75.84%。在超聲功率為420 W時(shí)，EAI值和ESI值均最大，分別為45.55 m2/g和93.32%，與對(duì)照組有顯著性差異，說明超聲波處理可以明顯改善水溶性豬肝蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

圖1 超聲波功率對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on emulsification andemulsion stability of pig liver water-soluble protein

超聲波處理時(shí)間對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖2所示。隨著超聲波處理時(shí)間延長(zhǎng)，豬肝蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性逐漸增加，在7 min時(shí)達(dá)到最大值，分別為43.54 m2/g和86.64%，超過7 min后，乳化性和乳化穩(wěn)定性明顯減小。有研究證明蛋白質(zhì)的乳化性與其溶解度呈正相關(guān)關(guān)系，溶解度越大，蛋白質(zhì)乳化性越高[21]。可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚淼目栈?yīng)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白分子展開形成非共價(jià)鍵分子，與水的結(jié)合能力增強(qiáng)，溶解度增加。當(dāng)超聲功率超過420 W或超聲時(shí)間超過7 min時(shí)，乳化性和乳化穩(wěn)定性不斷減小，這可能是蛋白質(zhì)在過高功率或過長(zhǎng)超聲時(shí)間處理時(shí)，蛋白質(zhì)變性程度增加，凝集程度加劇，分子表面親水性基團(tuán)大量減少，導(dǎo)致溶解度降低，蛋白乳化性減小。

圖2 超聲波時(shí)間對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on emulsification andemulsion stability of pig liver water-soluble protein

2.1.2 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液乳析穩(wěn)定性的影響

超聲波功率對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液乳析指數(shù)的影響如圖3-A所示。經(jīng)過14 d儲(chǔ)藏穩(wěn)定性觀察表明，水溶性豬肝蛋白乳液的分層情況隨著時(shí)間的變化有所不同。其中未經(jīng)超聲處理的乳化液乳析指數(shù)最高，均超過68.5%，說明乳液穩(wěn)定性最差。但是處理組隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，不同功率處理得到的乳化液乳析指數(shù)均不斷增加。在儲(chǔ)藏1 d時(shí)，乳化液已經(jīng)出現(xiàn)明顯乳析現(xiàn)象，體系失穩(wěn)，乳析指數(shù)均大于50%，且在300～420 W 范圍內(nèi)，隨著功率增大，乳析指數(shù)逐漸減小，說明蛋白超聲波處理有利于乳化液的穩(wěn)定性。對(duì)照組和低功率300 W組乳液具有較弱穩(wěn)定性，原因可能是在油滴表面形成不完整和不穩(wěn)定的界面膜，水溶性蛋白并沒有完全展開形成可以包裹油滴的結(jié)構(gòu)，使乳液液滴發(fā)生絮凝和變形。而適當(dāng)超聲處理后水溶性蛋白更容易吸附于油滴界面，可以增加乳液界面蛋白膜強(qiáng)度，而且超聲空化效應(yīng)使蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露，可以通過空間位阻作用為乳液液滴提供足夠的排斥力，抑制液滴之間的相互作用，降低乳析現(xiàn)象發(fā)生[22]。

A-不同功率；B-不同超聲時(shí)間圖3 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液乳析指數(shù)的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatment on the creamingindex of pork liver water-soluble protein emulsion

超聲波處理時(shí)間對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液乳析指數(shù)的影響如圖3-B所示。超聲波處理時(shí)間對(duì)乳化液的乳析指數(shù)影響明顯，儲(chǔ)藏時(shí)間相同時(shí)，超聲處理時(shí)間不同，乳析指數(shù)不同。乳化液放置1 d后就會(huì)出現(xiàn)明顯乳析現(xiàn)象，各處理組的乳析指數(shù)均在50%以上，且隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，不同組乳化液乳析指數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，靜置7 d后乳析指數(shù)體系維持穩(wěn)定。乳化液在同一放置天數(shù)，超聲時(shí)間為7 min時(shí)，乳析指數(shù)最低，表示乳化穩(wěn)定性最佳，與2.1.1結(jié)論一致。原因是適當(dāng)時(shí)間的超聲波處理后產(chǎn)生的空化效應(yīng)使原有的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而變得疏松，疏水性基團(tuán)暴露在外面，蛋白更容易分散在水中，使豬肝蛋白最大限度地溶解，改善乳化液的穩(wěn)定性，抑制液滴的變形和聚結(jié)。當(dāng)超聲波處理時(shí)間超過7 min時(shí)，蛋白微粒間可能因?yàn)殪o電作用發(fā)生聚集，一部分暴露的疏水性基團(tuán)被包埋，導(dǎo)致液滴發(fā)生失穩(wěn)現(xiàn)象，從而使乳析指數(shù)增加。

2.2 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化特性影響的機(jī)理

2.2.1 表面張力的變化

界面行為對(duì)乳狀液的制備和穩(wěn)定性有著重要的意義，乳化液的界面張力越小，穩(wěn)定性越好[23]。水溶性豬肝蛋白乳液的乳化特性通過測(cè)定乳液的表面張力進(jìn)行表征。蛋白質(zhì)吸附在乳液的油水界面上，能迅速降低表面張力，從而增加乳液的穩(wěn)定性阻止液滴的聚集。超聲波處理對(duì)乳化液表面張力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液界面蛋白吸附量的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment on the interfacialprotein content of pork liver water-soluble protein emulsion

由圖4可知，對(duì)照組乳液的表面張力為28.63 mN/m，明顯高于處理組，證明超聲處理可以降低乳液的表面張力、增強(qiáng)蛋白質(zhì)在油滴表面的吸附性，從而改善乳液的乳化穩(wěn)定性。隨著超聲功率的增加，樣品的界面張力值先減小后有所回升，在420 W時(shí)達(dá)到最小值21.65 mN/m。可能是因?yàn)檫m當(dāng)超聲處理后，蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在油水界面具有較高的吸附力，界面張力較小。當(dāng)功率過大后，界面蛋白質(zhì)發(fā)生自聚行為，造成蛋白質(zhì)在油水界面伸展能力減小，乳液的表面張力就會(huì)變大。

超聲處理時(shí)間對(duì)乳液的界面張力也會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響(圖4)。隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，豬肝蛋白乳液的表面張力先減小后增加，在7 min時(shí)表面張力值最小為26.42 mN/m，13 min后表面張力值趨于平緩，接近對(duì)照樣。原因可能是超聲處理后水溶性豬肝蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，親水性基團(tuán)暴露，提高了蛋白質(zhì)在油-水界面的吸附力，降低表面張力。而當(dāng)處理時(shí)間過長(zhǎng)后，蛋白質(zhì)變性程度增加，降低了蛋白質(zhì)與水結(jié)合的能力，導(dǎo)致表面張力增加。

2.2.2 界面蛋白組成

超聲處理的乳液界面蛋白SDS-PAGE電泳圖譜如圖5所示，該結(jié)果與CHAN等[24]的肌漿蛋白圖譜相似。

泳道M-marker；圖A泳道1-6-超聲波功率分別為0、300、360、420、480、540 W；圖B泳道1-5：超聲波時(shí)間分別為4、7、10、13、16 min；MHC-肌球蛋白重鏈；Actin-肌動(dòng)蛋白圖5 不同超聲波處理蛋白穩(wěn)定的乳液中吸附蛋白電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of adsorbed proteins inemulsions stabilized by proteins after treatment of differentultrasonic treatment

由圖5-A可以看出，與泳道1對(duì)照樣的界面蛋白相比，經(jīng)不同超聲波強(qiáng)度處理的界面水溶性豬肝蛋白條帶分布沒有明顯變化，說明不同超聲強(qiáng)度處理對(duì)吸附蛋白的亞基沒有顯著影響。但超聲波改性后電泳圖譜較改性前完整且清晰，處于66.4～97.2 kDa間有細(xì)小條帶出現(xiàn)，這可能是因?yàn)槌暡ǜ男院筇岣吡私缑娴鞍椎娜芙庑浴Ｓ镜?的圖譜顏色較其他泳道顏色深，說明界面蛋白含量最高，符合2.1.2的結(jié)論。由圖5-B可以看出，不同超聲時(shí)間條件下蛋白的凝膠色譜條帶間不存在明顯差異。但是與圖5-A泳道1未經(jīng)超聲處理的蛋白條帶相比，不同超聲時(shí)間處理的界面水溶性豬肝蛋白在分子量為66.4 kDa附近條帶增加。可能是因?yàn)槌曁幚砥茐牧说鞍组g的非共價(jià)作用，造成肽鍵斷裂，導(dǎo)致部分蛋白亞基產(chǎn)生不可逆降解。

2.2.3 乳液顆粒粒徑大小及分布

由圖6可知，對(duì)照組粒徑大于超聲波處理組粒徑且有顯著性差異。超聲波功率在300～420 W范圍時(shí)，乳化顆粒粒徑逐漸減小，乳化體系粒徑范圍為0.35～0.72 μm，且360和420 W超聲波處理之間差異不顯著(P>0.05)。功率在420～540 W范圍內(nèi)，水溶性蛋白乳化顆粒粒徑呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)且差異性顯著(P<0.05)，乳化體系粒徑范圍為0.35～0.54 μm。隨著功率變大，粒徑隨之增加，表明可能有乳液顆粒的小聚體形成。由圖6可知，經(jīng)過超聲波處理4～7 min后，乳化液顆粒粒徑從0.56 μm降低到0.38 μm，延長(zhǎng)超聲波處理時(shí)間能明顯降低D4,3。超聲波處理后粒徑較小，可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚磉^程中的超微束和紊流作用力，以及超聲波探頭的空化效應(yīng)。這與JAMBRAK等[25]的研究結(jié)論一致：隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，乳化液油滴粒徑逐漸增加，可能是因?yàn)槌L(zhǎng)時(shí)間的超聲處理誘發(fā)了乳液顆粒上附著的蛋白間的疏水或靜電等非共價(jià)作用而形成微小的物理聚集體，致使平均粒徑變大。

圖6 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液平均粒徑的影響Fig.6 Effects of ultrasonic treatment on the averageparticle size of pork liver water-soluble protein emulsion

由圖7-b可知，未經(jīng)超聲處理的乳液粒徑分布范圍為78～604 nm，經(jīng)過超聲處理后乳液粒徑范圍變窄，尤其是超聲時(shí)間為7 min時(shí)，乳液粒徑分布范圍變?yōu)?1～820 nm，這表明適當(dāng)?shù)某曁幚砜梢悦黠@影響乳液的粒徑范圍，使得乳液顆粒粒徑范圍變窄，分布更加集中，即乳液顆粒大小更加均勻。由圖7-a可知，對(duì)照組乳液的粒度分布范圍最廣，符合對(duì)照組乳液粒徑最小的結(jié)論。超聲處理組的乳液樣品中微粒均呈現(xiàn)三峰分布，包括占主導(dǎo)地位的主峰和從屬地位的2個(gè)肩峰，當(dāng)超聲功率小于420 W時(shí)，隨著功率增加，樣品粒度分布曲線有向左偏移的趨勢(shì)且分布越來越集中，說明所有區(qū)間內(nèi)的乳液粒徑呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。在較強(qiáng)的超聲物理作用力下，乳液的粒徑分布更加密集，原因可能是超聲的機(jī)械作用力破壞了原有的乳液顆粒粒徑分布區(qū)間，使得乳液顆粒粒徑分布更加集中。

圖7 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液微粒粒度分布的影響Fig.7 Effects of ultrasonic treatment on droplet sizedistribution of pork liver water-soluble protein emulsion

2.2.4 乳液液滴微觀結(jié)構(gòu)觀察

由圖8可知，對(duì)照組乳化液液滴大小不一，分布不均勻，液滴間有輕微聚集現(xiàn)象。經(jīng)過超聲處理后水溶性豬肝蛋白乳化液液滴分布出現(xiàn)明顯變化。圖8-A超聲功率為420 W和圖8-B超聲時(shí)間為7 min時(shí)乳化液液滴分散均勻，液滴顆粒較小，液滴間無明顯聚集現(xiàn)象，從微觀角度說明此條件下乳化液的乳化穩(wěn)定性較好，這與2.2.3結(jié)論一致。當(dāng)超聲功率為480 W和540 W時(shí)，液滴之間出現(xiàn)肉眼明顯可見的絮凝現(xiàn)象，顆粒明顯變大，表明乳液在此條件下出現(xiàn)嚴(yán)重脫穩(wěn)現(xiàn)象；超聲時(shí)間為13 min和16 min時(shí)，顯微鏡圖中液滴出現(xiàn)輕微聚集現(xiàn)象，說明在此范圍內(nèi)乳化液乳化穩(wěn)定性較差，這與2.1.2乳液的乳析指數(shù)分析結(jié)論一致。

圖8 超聲波時(shí)間對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化體系微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effects of ultrasonic time on micro structure ofpork liver water-soluble protein emulsion

2.2.5 乳化液的分子作用力

乳化液在不同溶劑中的蛋白溶解度表示其破壞某種化學(xué)鍵的能力，結(jié)果如表1所示。各組水溶性豬肝蛋白乳化液在試劑A(非特異性交聯(lián))、B(離子鍵)、C(氫鍵)、D(疏水作用力)、E(二硫鍵)中的溶解度均較低(<1 g/L)，表明5種作用力在乳化液形成過程中作用較小，其中非特異性交聯(lián)和二硫鍵的含量與其他作用力相比較高(P<0.05)。

經(jīng)過超聲波處理后，乳化液在溶劑A(非特異性交聯(lián))和溶劑B(離子鍵)中的蛋白質(zhì)溶解度隨著超聲功率的升高和超生時(shí)間的延長(zhǎng)均先降低后基本維持不變。乳化液中的蛋白在溶劑A中的變化可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚懋a(chǎn)生的空穴效應(yīng)導(dǎo)致形成乳化液的水溶性豬肝蛋白部分變性和降解產(chǎn)生蛋白損失，蛋白之間的非特異性交聯(lián)作用被削弱，蛋白溶解度呈現(xiàn)不同程度的減小。造成離子鍵變化的原因可能是由于超聲波的作用，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生變化，活性基團(tuán)被大量包埋或者參與了非二硫共價(jià)鍵的形成，導(dǎo)致離子鍵數(shù)量逐漸減小[26]。由表1可知，離子鍵并不是維持乳化液穩(wěn)定的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的主要貢獻(xiàn)。乳化液在溶劑C(氫鍵)和溶劑D(疏水作用力)中的蛋白質(zhì)溶解度變化趨向類似，均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。前者可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚砗螅鞍锥?jí)結(jié)構(gòu)被破壞，但是蛋白本身具有一定持水性，且鏈之間形成大量氫鍵，因此氫鍵含量有所增加，然而當(dāng)處理強(qiáng)度增強(qiáng)和時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，超聲對(duì)氫鍵的破壞作用占主導(dǎo)，氫鍵含量有所下降。后者是因?yàn)樵诔曁幚碇埃蟛糠质杷鶊F(tuán)被包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，超聲波的空穴效應(yīng)和微束流作用使這些基團(tuán)暴露出來，蛋白的疏水作用力增加，當(dāng)超聲達(dá)到一定強(qiáng)度和時(shí)間后，蛋白質(zhì)增加的表面疏水性并沒有轉(zhuǎn)化成乳液蛋白中的疏水作用力，而又被包裹在蛋白的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。而乳化液在E(二硫鍵)中的蛋白溶解度先增加后基本維持穩(wěn)定。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是因?yàn)槌曁幚頌榛钚詭€基提供更多能量，使其處于高能狀態(tài)，從而降低了活性巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵的活化能，促進(jìn)分子內(nèi)部的巰基形成二硫鍵。

表1 超聲波處理對(duì)水溶性豬肝蛋白乳化液非共價(jià)作用力的影響 單位:g/L

注：A～E分別代表組間數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)

3 結(jié)論

通過測(cè)定豬肝水溶性蛋白乳液的乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性和乳析穩(wěn)定性，表明適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚?420 W，7 min)有利于乳化液的穩(wěn)定性，且可以明顯改善水溶性豬肝蛋白的乳化活性，提高蛋白乳液的乳化穩(wěn)定性。

通過對(duì)表面張力、界面蛋白吸附量、蛋白組成、乳化液微觀結(jié)構(gòu)和乳液的分子作用力等指標(biāo)的分析探討，表明超聲功率和時(shí)間的增加，豬肝水溶性蛋白乳液界面張力會(huì)減小，界面蛋白發(fā)生自聚行為，蛋白的非特異性交聯(lián)作用和離子鍵均先降低后基本維持不變，二硫鍵則先增加后基本維持穩(wěn)定；適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚?420 W，7 min)可使蛋白乳液顆粒粒徑范圍變窄，分布更加集中，且液滴間無明顯聚集現(xiàn)象。

綜合分析表明，超聲波處理豬肝水溶性蛋白能有效改善其乳化效果，且當(dāng)超聲波功率為420 W，時(shí)間為7 min時(shí)效果最佳。