大黃素對缺氧復氧心肌細胞凋亡、氧化應激及AMPK信號通路蛋白表達的影響

曹 軍,劉志強,楊東偉

1)新鄉市中心醫院急診科 河南新鄉 453000 2)新鄉市中心醫院心血管內四科 河南新鄉 453000 3)鄭州大學附屬鄭州中心醫院心血管內科 鄭州450100

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者逐漸增多，已成為世界范圍內的主要死亡原因之一。及時恢復缺血心肌的血流量可降低梗死面積，降低病死率，但是這種治療極易導致心肌缺血再灌注損傷[1-2]。有研究[3]報道，大黃素可通過降低血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量，保護心肌細胞免受缺血再灌注損傷，改善心功能。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是心力衰竭治療中公認的新興靶標，在心力衰竭過程中發揮重要的調控作用[4-5]。本研究以大黃素處理缺氧復氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)心肌細胞H9c2，觀察細胞凋亡、氧化應激和AMPK信號通路蛋白表達的變化，揭示大黃素對H/R心肌細胞的保護功能及可能的機制，為大黃素的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑及儀器心肌細胞H9c2購自ATCC。大黃素購自廣東中山康之源生物有限公司，純度≥98%；大黃素標準品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:0756.200110)。DMSO購自美國MPBIO公司，DMEM培養基購自美國Sellect公司。AMPK信號通路抑制劑Compound C購自美國Calbiochem公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，LDH、丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。抗p-AMPK、抗p-ACC抗體購自Abcam公司，抗GAPDH抗體購自CST公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自上海瑞齊生物科技有限公司。

1.2H/R細胞模型的建立將H9c2細胞用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、體積分數5%CO2的恒溫培養箱中常規培養。當細胞生長至75%融合時，用胰蛋白酶消化細胞并傳代。將H9c2細胞用低氧緩沖液(139 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，0.5 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L CaCl2，5 mmol/L Hepes，20 mmol/L乳酸鈉)，于體積分數95%N2、5%CO2的封閉培養箱中缺氧處理12 h，然后去掉培養液，重新更換為含血清的DMEM培養基，于37 ℃、體積分數95%O2和5%CO2條件下培養4 h，H/R心肌細胞模型制備結束。

1.3不同濃度大黃素對H/R H9c2細胞活性及凋亡的影響

1.3.1 實驗分組 實驗分5組?？瞻讓φ战MH9c2細胞正常培養。模型組細胞按1.2方法制備H/R細胞模型。大黃素2.5、5.0和10.0 μmol/L組細胞按1.2制備H/R模型后，分別用2.5、5.0、10.0 μmol/L的大黃素處理48 h。

1.3.2 細胞活性檢測 分別收集5組細胞，調整至1×105個/mL，取100 μL接種于96 孔板，每組3個復孔。加入CCK-8試劑共培養約4 h后，用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度，以吸光度值表示細胞活性。實驗重復3次。

1.3.3 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測。分別收集5組細胞，調整至1×105個/mL。取 500 μL細胞懸液，加入5 μL的 Annexin V-FITC避光反應20 min，再加入5 μL的PI避光反應20 min，用300目銅篩過濾，1 h內上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.4大黃素對H/R H9c2細胞活性、氧化應激及AMPK信號通路蛋白表達的影響

1.4.1 實驗分組 實驗分4組?？瞻捉MH9c2細胞正常培養48 h。模型組細胞按1.2方法制備H/R細胞模型。大黃素組制備H/R細胞模型后，用5.0 μmol/L大黃素處理48 h。大黃素+抑制劑組制備H/R細胞模型后，用5.0 μmol/L大黃素和10 mmol/L的Compound C共同處理48 h。

1.4.2 細胞活性及凋亡的檢測 方法同前。

1.4.3 細胞LDH、MDA分泌量的檢測 分別收集4組細胞的培養上清，400×g離心5 min，取100 μL上清于酶標板中，按照試劑盒說明書操作，檢測LDH、MDA含量。實驗重復3次。

1.4.4 細胞中p-AMPK、p-ACC蛋白的表達 分別收集4組細胞，加入裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜，用50 g/L脫脂奶封閉2 h，洗膜，加入一抗(1∶500、1∶1 500稀釋)4 ℃過夜孵育，洗膜，加二抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育2 h。加發光液，曝光。采用Image J分析目的條帶的灰度值，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.5統計學處理采用PEMS 3.2進行數據分析。多組間細胞活性,凋亡率,細胞LDH和MDA分泌量,p-AMPK、p-ACC表達水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同濃度大黃素處理后H/R H9c2細胞活性及凋亡率的變化5組細胞活性和凋亡率檢測結果見表1。與空白對照組相比，模型組細胞活性降低，凋亡率升高(P<0.05)；與模型組相比，大黃素5.0、10.0 μmol/L組細胞活性升高，凋亡率降低(P<0.05)。選用5.0 μmol/L 大黃素用于后續實驗。

表1 5組H9c2細胞活性、凋亡率的比較

2.24組細胞活性和凋亡率的比較見表2。與空白組相比，模型組細胞活性降低，凋亡率升高(P<0.05)。大黃素組細胞活性較模型組升高，凋亡率降低(P<0.05)。與大黃素組相比，大黃素+抑制劑組細胞活性差異無統計學意義，凋亡率升高(P<0.05)。

表2 4組細胞活性、凋亡率的比較

2.34組細胞LDH、MDA分泌量的比較結果見表3。與空白組比較，模型組和大黃素+抑制劑組細胞LDH、MDA分泌量升高；大黃素組細胞LDH、MDA分泌量較模型組和大黃素+抑制劑組降低(P<0.05)。

表3 4組細胞LDH、MDA分泌量的比較

2.44組細胞中AMPK信號通路蛋白表達的比較結果如圖1和表4。模型組細胞中p-AMPK、p-ACC蛋白表達較空白組降低(P<0.05)，大黃素組細胞中p-AMPK、p-ACC蛋白表達較空白組升高(P<0.05)，大黃素+抑制劑組細胞中兩個蛋白的表達較大黃素組降低(P<0.05)。

1:空白組；2：模型組；3：大黃素組；4：大黃素+抑制劑組

表4 4組細胞中AMPK信號通路蛋白表達的比較

3 討論

大黃在我國具有悠久的藥用歷史，其為一種天然的蒽醌衍生物，具有廣泛的藥理作用，具有抗癌、保肝、抗炎、抗氧化和抗菌[6]活性。Ye等[7]研究發現，大黃素通過抑制細胞凋亡，提高了H/R誘導的心肌細胞的體外存活率，降低了體內心肌梗死面積；抑制了H/R誘導的心肌細胞中Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子(MyD88)、磷酸化IκBα、磷酸化NF-κB和炎性小體細胞溶質復合物(NLRP3)的表達。Wu等[8]研究發現，大黃素可通過抑制炎癥和凋亡過程保護心肌細胞免受損傷，降低急性心肌梗死小鼠的梗死面積。本研究結果顯示，大黃素可顯著增強H/R誘導的心肌細胞的活性，抑制其凋亡；進一步研究發現，大黃素還可抑制H/R心肌細胞LDH、MDA分泌量，抑制H/R誘導的心肌細胞氧化應激損傷，這為大黃素治療心肌梗死提供了充分的理論依據。

活化的AMPK可以提高ATP濃度，以滿足心肌細胞的能量需求[9-10]，因此，活化AMPK在預防和治療缺血性心臟病方面具有潛在的臨床價值[11]。Hu等[12]報道，卡維地洛通過調節AMPK信號通路縮小了缺血再灌注引起的心肌梗死面積，改善了心臟功能。Ma等[13]報道，AMPK信號通路通過減弱氧化應激和內質網應激，調節細胞凋亡和自噬，改善抗炎機制，減輕心肌缺血再灌注損傷?？梢?，AMPK信號通路在心力衰竭中發揮了重要的調控作用。本研究結果顯示，H/R心肌細胞中AMPK信號通路關鍵蛋白p-AMPK、p-ACC的表達下調，而大黃素處理后其表達水平明顯上調，說明AMPK信號通路的活化程度與大黃素的功能具有緊密的相關性；用AMPK信號通路抑制劑可逆轉大黃素對其的凋亡抑制和抗氧化應激作用，提示AMPK信號通路可能是大黃素發揮功能的下游調控通路。

綜上所述，大黃素可增強H/R心肌細胞的活性，抑制其凋亡和氧化應激反應，其機制與激活AMPK信號通路有關。這為大黃素治療心肌損傷疾病提供了依據。