母鼠高脂喂養(yǎng)與胎鼠心肌損害的關(guān)系

王 堯，覃有振， 彭慧敏， 王慧深，巴宏軍

1)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤中心 廣州 510080 2)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部心血管兒科 廣州 510080

高脂血癥與心血管疾病密切相關(guān)。研究[1]表明，家族性高膽固醇血癥的后代在出生時或兒童早期已開始形成冠狀動脈粥樣硬化，到青春期已較明顯。 已有研究[2]表明，妊娠期婦女普遍存在高脂血癥，妊娠期高脂血癥可導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育異常并可持續(xù)至兒童期甚至成人期。妊娠期高脂血癥與新生兒高血糖及低出生體重等密切相關(guān)[3-4]，也可能是先天性心臟病發(fā)病的高危因素之一[5]。然而，妊娠期婦女脂代謝異常是否引起子代心肌異常尚不明確。本研究擬通過孕期高脂喂養(yǎng)誘發(fā)SD大鼠妊娠期高脂血癥，觀察妊娠期高脂血癥對胎鼠心肌細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的影響，探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1動物來源與分組鼠齡96～103 d、體重240～260 g的清潔級SD大鼠30只，雌鼠20只，雄鼠10只, 購于廣州市中醫(yī)藥大學(xué)動物研究中心[SCXK(粵) 2013-0034]。先置于濕度60%～70%、室溫18～25 ℃的環(huán)境中予普通飼料行適應(yīng)性喂養(yǎng)。3 d后雌雄按2∶1比例合籠,次日清晨陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子為受孕，記為妊娠第0天。孕鼠隨機分為兩組，每組10只，分別予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，妊娠第21天為喂養(yǎng)終點。普通飼料及高脂飼料均購于廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心。普通飼料由粗蛋白(20.7%)、粗纖維(38%)、粗灰分(26.6%)、粗脂肪(4.2%)、水分(8.2%)、礦物質(zhì)(2.3%)組成。高脂飼料由膽固醇(1%)、膽鹽(0.2%)、豬油(10%)、蛋黃粉(10%)、普通飼料(78.8%)組成。

1.2標(biāo)本采集和處理所有大鼠在實驗開始前一天下午2：00開始禁食，禁食16 h后尾部采血，3 000 r/min離心10 min，于低溫冰箱凍存?zhèn)洳檠?。妊娠?1天再次留取血樣；剖宮取胎， 每只母鼠隨機選取一只胎鼠，取大小約1 mm×1 mm×1 mm的胎鼠心尖部組織置于多聚甲醛溶液中固定，備行組織學(xué)觀察。

1.3母鼠血脂檢測血脂檢測包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)。試劑盒由雅培公司提供。

1.4胎鼠心肌組織學(xué)表現(xiàn)取胎鼠心尖部心肌組織，于多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋后切片(厚度5～6 μm)，然后行HE染色。每只胎鼠隨機選擇3張切片于400倍鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變并計算病變積分[6]。心肌病變包括脂肪顆粒沉積、胞核染色加深、細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊等。計分規(guī)則：無病變?yōu)? 分, 病變范圍<25%、25%～50%、51%～75%、>75%分別記為1、2、3、4分。每張切片選取5個視野,計算平均得分。試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.5胎鼠心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測采用TBA方法檢測胎鼠心肌組織中丙二醛(MDA)水平，采用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶總活力(T-superoxide dismutase,T-SOD)。試劑盒購買自南京建成生物工程研究所。

1.6胎鼠心肌組織中磷酸化P38(p-P38)、P53蛋白的檢測分離胎鼠心尖部心肌組織，用RIPA裂解液裂解，4 ℃高速離心提取組織蛋白,使用BCA 法進(jìn)行定量,煮沸后行SDS-PAGE分離蛋白(美國Bio-Rad公司,恒壓80～110 V,1.5 h)。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，分別加入p-P38、P53抗體(均1∶500稀釋)、GAPDH 抗體(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜，洗膜3 次后加入二抗于室溫下孵育1 h?？贵w均購自美國Abcam 公司。ECL發(fā)光液顯色(A液和B液按1∶1混合)。利用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組母鼠孕前及孕第21天血脂水平的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組胎鼠心肌組織中T-SOD活性、MDA水平、p-P38、P53 蛋白表達(dá)水平的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠孕前及孕第21天血脂水平的比較見表1。孕前、孕第21天A組母鼠血脂水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。B組孕第21天TC、TD、LDL-c較孕前顯著升高，HDL-c顯著降低。

表1 兩組母鼠孕前及孕第21天血脂水平的比較(n=10) mmol/L

2.2兩組胎鼠心肌組織學(xué)表現(xiàn)光鏡下觀察，A組胎鼠心肌細(xì)胞呈橢圓形,胞核形態(tài)規(guī)則,位于細(xì)胞中央, 呈圓形或橢圓形，核染色均勻,且胞漿豐富(圖1A )。B組胎鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰, 可見較多脂肪樣顆粒,胞核形態(tài)不規(guī)則且染色較深(圖1B)。A組胎鼠心肌組織病變積分為(0.60±0.11),B組為(1.26±0.65)， B組大于A組(t=3.166，P=0.005)。

左上、左下：A組100倍、400倍；右上、右下：B組100倍、400倍

2.3兩組胎鼠心肌組織中T-SOD活性與MDA水平的比較B組胎鼠心肌組織中T-SOD活性及T-SOD/MDA比值較A組降低，MDA水平較A組升高，見表2。

表2 兩組胎鼠心肌組織中T-SOD活性及MDA水平的比較

2.4兩組胎鼠心肌組織中p-P38、P53蛋白表達(dá)的比較見圖2及表3。與A組比較，B組胎鼠心肌組織中p-P38、P53 蛋白表達(dá)上調(diào)。

圖2 兩組胎鼠心肌組織中p-P38 和P53蛋白的表達(dá)

表3 兩組胎鼠心肌組織中P53和p-P38蛋白表達(dá)的比較

3 討論

妊娠是女性特殊的生理過程，在妊娠期，機體的組織器官會產(chǎn)生一系列生理功能的變化以適應(yīng)母體代謝及胎兒生長發(fā)育的需要，這其中包括血脂代謝狀態(tài)的改變。從生理角度講，孕期一定程度的血脂水平升高是保障胎兒正常發(fā)育所必需的，但是如果血脂水平超過一定程度，易導(dǎo)致機體損害，就屬于病理現(xiàn)象。既往研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，妊娠期高脂血癥可導(dǎo)致嚴(yán)重的妊娠期并發(fā)癥，如妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、急性胰腺炎等?？惮|等[9]的研究表明，大鼠妊娠期高脂血癥可影響子代成年期的血脂代謝并導(dǎo)致肥胖的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，孕期高脂喂養(yǎng)的母鼠存在嚴(yán)重的脂代謝紊亂，其胎鼠心肌細(xì)胞受損，提示孕期高脂血癥與胎鼠心肌細(xì)胞的損害有關(guān)。目前關(guān)于高脂血癥對心肌細(xì)胞損害的機制尚不明確。既往研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，高脂血癥可造成胎盤動脈粥樣硬化，并進(jìn)一步影響胎盤功能，可能與胎盤功能障礙所致遺傳物質(zhì)異常有關(guān)，然而具體的機制尚不清楚。也有研究[12]認(rèn)為，高脂血癥易致機體氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激水平升高可致機體器官結(jié)構(gòu)及功能損傷。因此，有必要進(jìn)一步探討母鼠高脂血癥對胎鼠心肌細(xì)胞損害的具體分子機制，尤其是與氧化應(yīng)激的關(guān)系。

氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由族和活性氮自由族產(chǎn)生過多,引起炎性細(xì)胞的侵入，造成組織損傷[13]。脂代謝異常是機體重要的代謝異常，高脂血癥與冠心病、糖尿病、代謝綜合征等密切相關(guān)，而氧化應(yīng)激參與了糖尿病、多囊卵巢綜合征、神經(jīng)病變等的發(fā)生發(fā)展[14-16]。高脂血癥是氧化應(yīng)激的主要誘因之一[12]。本研究結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)母鼠的胎鼠心肌組織中T-SOD水平較對照組下降，而MDA水平升高；同時心肌組織中p-P38、P53 蛋白表達(dá)較對照組上調(diào)。本研究結(jié)果提示孕期血脂代謝紊亂的母鼠體內(nèi)存在較高的氧化應(yīng)激水平，與文獻(xiàn)[17]報道的一致。氧化應(yīng)激水平升高容易啟動細(xì)胞凋亡程序，而細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激物質(zhì)可導(dǎo)致核酸損傷，進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子P53，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。因此，高脂血癥母鼠其胎鼠心肌損害可能與氧化應(yīng)激誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，母鼠高脂血癥會對胎鼠心肌細(xì)胞造成一定的損害，并且這種心肌損害可能與氧化應(yīng)激增強有關(guān)。因此，妊娠期合理安排營養(yǎng)及定期監(jiān)測血脂水平對維持胎兒健康具有十分重要的意義。