染色體微陣列分析技術在產前診斷中的研究進展

江梅花，陳先俠

早在20世紀70年代染色體G顯帶核型分析就已成為檢測胎兒染色體異常的金標準[1]，可以檢測3～10 Mb的大量非整倍體的重復、缺失及結構重排[2]，但細胞培養周期長(10～14 d)、制片過程復雜,并且對結果的解讀多依賴于主觀經驗[3]，不能發現亞顯微的缺失和重復。隨著染色體分析技術的發展，1969年Pardue和Gall[4]提出熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization, FISH),其不需要細胞培養，能快速檢測和定位染色體特定DNA序列的插入或缺失，是細胞遺傳學和分子生物學的第一次融合，為產前診斷學的發展提供了強大動力。然而，FISH只針對特定的染色體區域，一次只能檢測一個染色體位點(如微缺失綜合征)或多個候選染色體位點(如亞端粒區域)。多重連接探針擴增、定量熒光PCR 和細菌人工染色體微珠技術的引入彌補了FISH技術的不足，可以快速檢測更多位點的染色體非整倍體和基因的微缺失、微重復，大大縮短了產前診斷的時間，同時也提高了染色體不平衡的檢出率，但遺憾的是只能檢測某一區域的基因序列，不能在全基因組范圍內檢測染色體的不平衡。

染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)可檢測全基因組的微缺失和微重復而應用于臨床，主要作為對患有多種先天性異常、發育遲緩、智力殘疾和自閉癥譜系障礙的兒童進行出生后細胞遺傳學初步評估的第一層測試[5]，因其具有高通量、自動化程序高、分辨率高等優點，自2008年起CMA開始從“產后”走向“產前”[6]。前瞻性隊列研究表明，在核型分析結果正常而超聲提示結構異常和其他存在高危指征的孕婦中，CMA能夠分別額外發現6%和1.7%的臨床相關拷貝數變異(copy number variations, CNVs)[7]，故2013年美國婦產科醫師大會和母胎醫學學會建議將CMA作為對有重大結構異常的胎兒進行細胞遺傳學評估的第一層測試[8]。最新指南推薦，當發現胎兒畸形或頸項透明層(nuchal translucency, NT)≥3.5 mm時，應在快速非整倍體檢測后實施CMA，但后續結果需要由CMA專業人員給予遺傳咨詢[9]。

1 CMA概述

CMA也稱分子核型分析技術，通過檢測DNA的CNVs來診斷染色體異常。根據探針的設計原理不同，CMA分為比較基因組雜交微陣列(comparative genomic hybridization array, aCGH)和單核苷酸多態性微陣列(single nucleotide polymorphism arrays， SNP arrays)。

aCGH最初應用于癌癥領域[10]，即將患者和對照樣本的DNA進行不同的熒光標記，并與芯片上的互補探針雜交，再利用熒光染料不同顏色的強度繪圖，通過患者與對照樣本的DNA異常比率顯示CNVs。通過差異雜交信號aCGH可以檢測整個基因組中3～10 Mb分辨率的不平衡染色體重排[3]，但因分辨率低和技術挑戰限制了臨床推廣。2006年Rickman等[11]用目標DNA代替中期染色體，用金屬針或毛細玻璃管代替普通玻片，成功地在未培養的羊膜細胞上進行了aCGH研究，簡化了分析過程且縮短了周轉時間，進而顯著提高了分辨率。不同的aCGH分辨率取決于DNA探針的間距和長度，靶向微陣列主要用于檢測非整倍體、特征良好的微缺失和(或)微重復綜合征、亞端粒或其他不平衡染色體重排，以提高具有可變表型或外顯率的不確定臨床意義的變異(variant of uncertain significance， VOUS)或拷貝數變異(copy number variation， CNV)的檢測率。然而，aCGH可能會在缺乏探針覆蓋的基因組區域內錯過潛在的具有重大臨床意義的CNV。此外，少量芯片為全基因組aCGH，因其探針可覆蓋整個基因組，因此能夠檢測出高分辨率的CNVs，同時VOUS的檢出率也大大增加，臨床使用時要考慮CMA平臺及其局限性。

SNP arrays主要使用由短序列(25～60 bp)核苷酸組成的單核苷酸探針，通過確定數百萬多態位點的基因型以識別缺失或重復的DNA片段。與aCGH相比，SNP arrays不需要參考樣本即可確定個體間高度多態基因組特定區域的基因型，通過評估陣列上的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism， SNP)等位基因模式，進而識別aCGH不能檢測到的三倍體。此外，SNP還可以額外檢測單親二倍體(ulrich's periodicals directory, UPD)、嵌合體、合子、母系細胞污染和親緣關系[12]。目前SNP技術已廣泛應用于先天性異常、認知缺陷、發育延遲、生長異常或行為異常的臨床評估[13]。

2 CMA在產前診斷中的應用

2.1CMA在超聲檢查為異常胎兒中的診斷 隨著社會的發展，人們認識到胎兒結構異常與基因組失衡之間存在著密切的關聯性，特別是與唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征相關的結構異常。與核型分析相比，產前檢查發現胎兒超聲結構異常時，CMA診斷常見非整倍體染色體異常的準確率可達100%[14]。有研究指出，與CMA異常最密切相關的器官及系統主要包括心臟、腎臟、骨骼、泌尿生殖系統和中樞神經系統。國外研究表明，66.7%的心臟缺損患者為CNVs，而非22q11.2缺失[15-17]。此外，超聲檢查結果提示胎兒心臟結構異常時，常使用FISH檢測其是否存在22q11.2缺失，往往忽略了超過2/3的基因組異常。因此，對于特定的心臟結構異常，FISH檢測的診斷率可能會大大降低[16]。有數據表明，CMA對心臟結構異常和腎臟分離的診斷率較核型分析相比分別增加了10.6%和15.0%，診斷率位于胎兒單器官畸形診斷第一位[17]。最新一項研究證實,CMA對最常見的先天性心臟缺損(如室間隔缺損)的CMA致病性CNV檢出率明顯高于核型分析，且對孤立的心流出道異常檢出率(36.1%)顯著高于非孤立型(1.3%)[18]。Sun等[19]采用SNP arrays分析技術檢測到胎兒在4q35.2處出現0.72 Mb重復，與癲癇和心臟異常有關，同時在PARK 2基因的6q26處發現了0.13 Mb的缺失，且與常染色體隱性遺傳病(如青少年帕金森病)有關。國外研究表明，由UPD導致的部分腎臟疾病(如貝克德-威德曼綜合征和羅素-銀綜合征)可以表現為特殊的超聲結構異常，此種情況只能由SNP arrays分析技術加以證實[20-21]。Borrell等[22]對CMA和核型分析在胎兒生長受限中的診斷率進行了系統回顧和meta分析，數據顯示，在非畸形和畸形的胎兒生長受限中，CMA較核型分析診斷率分別增加了4%和10%，最常見的致病性CNV為22q11.2型。

此外，涉及臨床顯著基因組區域的微缺失和微復制也與特定的遺傳綜合征有關，如77%的DiGeorge綜合征患兒是由于22號染色體近端長臂區的亞顯微缺失[23]、Miller Dieker綜合征為17號染色體短臂末端微缺失導致大腦皮層發育不足或發育不良、包含HNF1B基因的17q12微缺失與腎囊腫和糖尿病綜合征有關[20-21]。Srebniak等[24]通過SNP arrays分析技術對1033例超聲異常的胎兒進行研究，結果表明，約5.5%的患兒具有致病性CNV，其中58%與病因有關，35%為神經發育障礙相關疾病，6%為意外發現的早發型疾病，建議孕婦將SNP arrays分析技術作為胎兒超聲檢查異常的第一層測試。

2.2CMA在核型分析及超聲檢查為正常胎兒中的診斷 在超聲檢查和核型分析正常的孕婦中，CMA能夠檢測出額外的非整倍染色體發生風險，如亞顯微畸變導致的早發性疾病、攜帶神經發育障礙易感位點及晚發性疾病[25]。Srebniak等[24]回顧10 614例核型分析正常的父母親的臨床資料，采用meta分析評估CMA技術，結果發現，0.84%的高齡產婦(advanced maternal age, AMA)和有焦慮情緒的父母親出現了具有臨床意義的致病性CNV，且36歲以下的產婦患有致病性CNV的風險高于唐氏綜合征的發生風險(1∶180)。Li等[26]對72例NT>5 mm的孕婦進行研究，并在核型分析正常的情況下進行CMA，結果顯示，染色體缺陷胎兒12例，其中致病性CNVs 5例。目前NT測量在我國早已普及，當NT異常時，孕婦會選擇無創DNA或核型分析，CMA雖然能夠識別超聲檢查和核型分析未能檢測出的染色體異常，但在AMA或早孕篩查異常的孕婦中暫未普及，其中最主要的原因是部分CNVs(如16p11.2微缺失)臨床暫時難以確定其基因型-表型相關性，但是伴隨時間的推移、遺傳學相關知識的不斷更新、共享數據庫內容的擴充及與疾病有明確關聯性的基因組數量不斷地增加，終將使VOUS的發生率不斷降低，如最初美國兒童健康與人類生長發育研究所發現的致病性CNV和VOUS的發病率分別為0.9%和2.5%，而根據最新的研究結果及全球數據知識共享，發現致病性CNV的發病率增加到1.8%，VOUS的發生率減少到0.9%[27]。

2.3CMA在流產組織中的應用 妊娠丟失是一個常見的生殖問題，臨床15%～20%的妊娠以自然流產告終，并且約1%的女性經歷過多次流產[28]。Zachariah等[29]研究報道，流產病因分析對女性未來的生育計劃和未來妊娠的產前護理有重大影響。當第一次妊娠以流產告終，再次妊娠的圍產期不良結局(如胎膜早破、早產、胎兒生長受限、子癇前期和剖宮產)的發生風險會增加。有學者發現孕20周之前發生自然流產的女性中約50%是由染色體異常引起，主要表現為染色體數目及結構異常，其中結構畸變和嵌合體發生率則較低[17]。22q11.21和1p36.33缺失為最常見的致病性CNV[30]。傳統的核型分析需要先對新鮮的流產組織細胞進行培養，因培養周期長、失敗率高和母體細胞易污染等問題導致假陰性率較高。CMA具有較高的自動化程序和診斷率，并且對標本的要求較低(無需新鮮的流產組織)，一方面可檢測非整倍染色體和更大的結構變化，另一方面還能發現嵌合體及流產組織中微妙的染色體失衡，在流產組織分析中具有廣闊的應用前景。Sahoo等[31]對8118例流產組織進行了CMA，結果顯示，CMA對新鮮標本的診斷率達94.2%，對非新鮮標本的診斷率達86.4%，可最大限度地提高敏感度，減少假陰性。有研究顯示，CMA對早期自然流產組織的診斷率明顯高于常規核型分析，并且CMA還能檢測出與臨床相關的遺傳信息[30]。

2.4CMA在著床前遺傳診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD)和植入前基因篩查(preimplantation genetic screening, PGS)中的應用 目前PGD主要用于單基因遺傳疾病攜帶者(顯性和隱性、常染色體或X連鎖)和結構染色體異常攜帶者的診斷；PGS主要用于輔助生殖治療，通過移植整倍體胚胎來提高妊娠成功率。在PGS應用過程中，由于CMA不存在組織培養失敗、人為因素等問題，加之周轉時間較快，已逐漸取代FISH[32]。PGS聯合CMA除了能識別一般的染色體異常，還能識別復雜染色體重排。Frumkin等[33]對1例核型分析證實胎兒染色體正常的父母親進行分析，經CMA檢測發現父親染色體出現46，XY，t(3；7；9)(q23；q22；q22)復雜易位，提示臨床可通過PGD聯合CMA選擇性移植1個染色體正常的胚胎，進而得到1個健康的嬰兒。

與FISH和aCGH相比，SNP arrays分析技術可以同時生成與整個染色體相關的定性(基因型)和定量(基因拷貝數)數據，并且已經應用于植入前胚胎胚卵裂球和囊胚滋養外胚層細胞的遺傳學分析，主要用于檢測46條染色體的非整倍體。Yao等[34]通過SNP arrays分析技術發現從不正常受精卵或質量不佳的受精卵中提取的人類胚胎可以發育為囊胚，為將來胚胎的研究和臨床應用提供了理論依據。

3 CMA的優勢與局限性

與傳統細胞學診斷相比，CMA的優勢如下：①可以分析更廣泛地組織類型，不需要進行組織培養，可對從未培養的絨毛、羊水、胎兒組織和血液中提取的DNA進行CMA，包括保存的標本和石蠟切片[32]；②可以檢測到分辨率為0.05～0.1 Mb的亞顯微缺失和重復，而核型分析常識別分辨率為3～10 Mb的染色體改變[35]；③可以根據研究目的定制特異性平臺；④屬于客觀評價而非主觀評價；⑤數據結果與基因組數據庫相兼容；⑥易于自動化，從而使周轉時間更快，降低故障率，具有更高的成本效益分析[33]。

與其他技術一樣，CMA也存在局限性：①不能識別平衡易位(倒數和羅伯遜)和倒置；②不能檢測小于10%低水平的嵌合體[35]；③可能漏掉四倍體和(或)三倍體；④易遺漏在平臺覆蓋范圍之外的CNV；⑤不能發現點突變、基因表達和甲基化異常；⑥負陣列并不能100%排除由個體突變和其他基因組原因所造成的疾病[32]；⑦若發現VOUS，在遺傳咨詢過程中可能會引起臨床醫師的困惑和父母親焦慮。然而，相信在不久的將來，由于共享臨床數據庫收集的相關信息，將會使得先前不確定的發現被重新歸類為良性或致病性范疇，VOUS的發生率亦會不斷降低。

4 產前咨詢與結果解讀

產前咨詢是為了讓患者更好地了解各種檢測方法的優點及其局限性，從而根據自身需求做出選擇。在絨毛膜采取、羊膜穿刺術后或PGS聯合絨毛膜采取時，均建議由遺傳學顧問、遺傳學專家或在遺傳咨詢方面具有專業知識的醫療保健提供者給予咨詢[36]。最新指南將CNVs解釋為致病、可能致病、不確定、可能是良性[37]。CNVs的醫學相關性與基因微缺失、基因復制功能有關，當失衡區域發生于關鍵基因或重要的調控區域時，可能產生表型效應。對于某些罕見的染色體畸變(14Q部分三體)或不確定意義的CNVs，因其需要對大量病例進行全面分析，故難以建立基因型-表型相關性，從而給臨床醫師向患者提供適當咨詢方面增加了負擔[38]。此外，最新指南建議對于CMA結果的解讀可以借鑒文獻和公開數據庫中的結果，包括基因組變異數據庫、解密數據庫、國際細胞基因組陣列標準和人類孟德爾遺傳數據庫等。

5 展望

與常規細胞學診斷相比，CMA在分辨率、成本效益、自動化程序等方面展現了其獨特的優勢，也逐漸應用于臨床各個領域。雖然在臨床應用時可能會存在VOUS,但隨著技術的不斷提高、CMA平臺的日漸成熟及更多大規模前瞻性隊列研究，CNV數據庫終將不斷完善，更多染色體疾病的基因型-表型關系將會闡明，逐漸解決臨床醫師所面臨的困難，相信CMA在未來產前診斷領域將展現更大的應用價值。