胎兒游離DNA在產前診斷中的應用

孔令霞，陳先俠

隨著國家二胎政策的全面放開，生育人數明顯增加，其中高齡產婦更是逐年增加。隨著孕婦人數及妊娠年齡等方面的增長，各種胎兒疾病如唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征等染色體非整倍體疾病的發病率也隨之增加。自1997年在孕婦外周血中發現胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)以來[1]，無創產前檢測便開始逐漸取代傳統的血清生化標志物篩查[2]以進行產前診斷[3]。隨著新一代基因測序技術的不斷發展，使得cffDNA在妊娠早期產前診斷的篩查中得到廣泛應用。本文就孕婦外周血cffDNA在產前診斷中的應用與發展進行綜述。

1 孕婦外周血中cffDNA的發現與來源

1.1cffDNA的發現 1969年Walknowska等[4]研究表明胎兒淋巴細胞的母體轉移很常見，可以通過母體血液中淋巴細胞的核型分析來進行男性胎兒的產前診斷，同時也可以識別胎兒染色體異常。1997年Lo等[1]通過PCR技術檢測出懷有男性胎兒的孕婦血清和血漿中均有男性胎兒Y染色體DNA序列，同時cffDNA的含量與孕周密切相關，最早可在妊娠第5周通過定量PCR技術在母體外周血中檢測出cffDNA，并在妊娠第7周與母體建立完整的胎盤循環，其含量隨孕周的增加而增加，這一發現為孕婦外周血中cffDNA作為產前檢測手段提供了重要依據，也為產前診斷開辟了新途徑。

1.2cffDNA的來源與獲取 cffDNA是一段雙鏈且高度片段化的DNA片段，大多數分子長度約為150 bp。雖然臨床研究證明孕婦外周血中存在cffDNA，但其來源目前尚不明確，推測有下列幾種可能：①來源于胎盤通道：游離的胎兒細胞通過胎盤通道滲透到母體血液當中，被母體免疫系統破壞，最終導致胎兒DNA殘留[1]；②來源于凋亡的胎兒細胞：胎兒細胞凋亡后降解、釋放出來的DNA通過直接跨膜轉運的方式轉運到母體外周血中[5]，并且以兩種形式存在于母體血液循環中，一種是以完整細胞的形式存在，另一種則是以cffDNA的形式存在；③來源于胎盤滋養層細胞：胎盤是連接胎兒與母體的直接通道，胎盤滋養層細胞的釋放與脫落是孕婦外周血中cffDNA出現的主要原因，其含量與孕周有關，并在分娩后2 h即從母體中消失。cffDNA的檢測和發現使得無創產前診斷得到了進一步的發展，但在臨床運用過程中仍面臨很大的挑戰，主要原因是cffDNA與母體DNA存在50%的共有序列[6]，而且母體外周血中的胎兒細胞包括滋養層細胞、淋巴細胞、粒細胞、造血干細胞和胎兒有核紅細胞等大量細胞，同時還存在嵌合細胞，使得滋養層細胞的含量很少，只有1%左右的滋養層細胞來源于母體[7]。在妊娠階段，cffDNA占母體血漿中總循環游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)的3%～13%[8]，若孕周小于12周時，cffDNA在孕婦外周血中的含量則較低，常低于4%，可能會導致無法檢測或者出現假陰性[9]。因此，提高胎兒DNA在孕婦外周血中所占比例是評估無創產前檢測技術(non-invasive prenatal testing， NIPT)檢測準確性的重要參數。Jorgez和Bischoff[10]通過DNA分子長度分級分離法和全基因組擴增法來提高cffDNA的富集效率，進而降低母體cfDNA比例來提高NIPT檢測結果的準確性。

2 cffDNA在產前診斷中的應用與發展

NIPT主要通過對孕婦血漿中的cffDNA進行測序來鑒定胎兒非整倍體疾病[11]，主要通過采集孕婦外周靜脈血，利用新一代DNA測序技術對孕婦外周血漿中的cfDNA片段進行測序，進而確定DNA片段及其染色體，再通過計算每一條目標染色體的片段數目，確定其是否較預期的cfDNA數量增加或減少，進而計算染色體序列數目比率，從而檢測胎兒是否患有唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征等染色體異常疾病[12]。

在cffDNA應用于產前診斷之前，妊娠早期主要通過血清生化標志物和產前超聲標記聯合檢測胎兒非整倍染色體疾病。血清生化標志物篩查原理是胎兒染色體如果發生異常可影響胎盤功能，從而導致孕婦出現胎盤分泌的相應血清生化指標異常。Christiansen等[2]研究發現，在妊娠第9～13周，與妊娠相關的血漿蛋白A水平下降、人絨毛膜促性腺激素β亞單位(human chorionic gonadotropin beta subunit, β-HCG)水平增高的孕婦存在唐氏綜合征的發生風險。雖然通過血漿蛋白A、游離β-HCG和胎兒頸項透明層(nuchal translucency， NT)的聯合篩查可診斷約90%的唐氏綜合征胎兒，假陽性率約5%[13]，并且對愛德華綜合征和帕托綜合征也有一定的篩查作用，但是該方法靈敏度有限，且無法對胎兒進行遺傳疾病檢測。

2.1在染色體非整倍體疾病方面的應用 1997年Lo等[1]在孕婦外周血中發現男性胎兒Y染色體特異性DNA片段，為cffDNA用于胎兒染色體非整倍體疾病的篩查提供了可能。1999年Lo等[14]通過定量PCR技術檢測出cffDNA的異常增高與胎兒唐氏綜合征有關，進而提出是否可以利用cffDNA水平變化作為產前檢測唐氏綜合征的標志物。有學者運用這一特性通過多重定量PCR技術對胎兒進行染色體非整倍體疾病的相關檢測[15]。隨著分子生物學技術的不斷發展及新一代高通量基因測序技術的出現，發現NIPT可以通過對cffDNA進行測序，進而對胎兒染色體非整倍體疾病進行篩查，并且cffDNA檢測能更早發現胎兒染色體異常，較傳統的產前診斷方法具有更高的的靈敏度和特異度[16]。

目前NIPT主要篩查高危孕婦的染色體非整倍體異常，對唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征這三大染色體疾病具有十分重要的意義，尤其是唐氏綜合征的檢出率可高達99%，假陽性率僅為0.13%[17]。

2.2在染色體微缺失疾病方面的應用 目前cffDNA已廣泛應用于無創性產前診斷，并不斷發展形成了NIPT升級版(NIPT-plus)，該技術是在NIPT常規應用cffDNA檢測13號、18號、21號等染色體非整倍體疾病的基礎上，以全基因平行測序技術為基礎，主要用于5號、9號、16號染色體及性染色體異常等相關疾病的檢測和篩查，同時還可檢測15q11-q13、5p15.2-15.3、22q11.2、1p36及4p16.3等常見的染色體微缺失疾病[18]，而這種染色體缺失通過常規染色體檢測方法不易檢測，NIPT-plus技術的發展為其提供了可能。

2.3在基因遺傳性疾病方面的應用 近年cffDNA逐漸應用于基因遺傳性疾病的檢測，通過DNA測序技術，分析父母親基因組的單倍型并鑒定致病基因位點周圍的單核苷酸多態性，再對母體外周血漿中cffDNA進行測序和相對單倍型劑量分析，進而推測胎兒的突變狀態。目前cffDNA已成功檢測如杜氏肌營養不良[19]、脊髓性肌萎縮[20]、β-地中海貧血[21]、先天性腎上腺皮質增生[22]及楓糖尿病[23]等基因遺傳性疾病。

2.4在胎兒RhD血型檢測方面的應用 若紅細胞缺乏D抗原，臨床稱為Rh陰性，而具有D抗原時則稱為Rh陽性。若血型為Rh陰性的母親再次妊娠血型為Rh陽性的胎兒時，妊娠期間可有少量胎兒血液進入母體的血液循環，進而產生大量IgG抗體，該抗體通過胎盤屏障引起胎兒溶血，導致新生兒溶血性疾病的發生[24]，出現黃疸、貧血、肝脾增大等嚴重的臨床表現，重者出生后即有嚴重貧血、胎兒水腫及心力衰竭等臨床表現。通過檢測cffDNA，在妊娠中晚期便可檢測出胎兒RhD血型，進而利用孕婦外周血中cffDNA對胎兒進行RhD基因分型，爭取對新生兒溶血性疾病的發生做到早發現、早預防和早治療。

2.5在女性相關癌癥方面的應用 有文獻報道，幾乎所有的癌癥都有體細胞基因改變，而這種體細胞基因改變可以通過循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)反映出來，而ctDNA是來源于腫瘤患者血液中的無細胞DNA部分[25]。cfDNA的改變往往會導致NIPT的檢測結果與胎兒檢測結果不一致，當出現NIPT與最終診斷結果不一致時，接診醫師要想到母體患有惡性腫瘤的可能，此時母體外周血中cfDNA更多的是來源于母體癌細胞，而不是胎兒細胞。

Ji等[26]通過研究證明了運用cffDNA檢測惡性腫瘤的可能，使得NIPT在拷貝數變異(copy number variations， CNVs)方面有著廣闊的應用前景，并且CNVs在ctDNA中的表征可作為腫瘤生物標志物。因此，利用NIPT可以推測女性癌癥的預后和復發情況。低覆蓋率全基因組測序的NIPT平臺能夠有效識別早期和晚期女性癌癥，并能預測預后，尤其是在女性卵巢癌、乳腺癌及子宮內膜癌晚期階段中的預測效果更好[27]，為檢測孕婦相關癌癥提供了可能，也為術后癌癥的復發提供了理論依據。

2.6在多胎妊娠方面的應用 隨著輔助生殖技術的迅速發展，其在解決了女性不孕不育的同時也使多胎妊娠的發生率逐漸升高，其中雙胎妊娠最常見。與單胎妊娠相比，多胎妊娠的相關妊娠疾病發病率增加，常規的產前篩查對于雙胎妊娠的檢測準確率遠遠低于單胎妊娠，而侵入性產前檢查又會使流產和感染的發生風險增加。有文獻報道，cffDNA檢測能在避免侵入性操作的同時對雙胎妊娠進行有效的產前篩查[28]。有研究表明雙胎非整倍體陽性發生率為1.9%～8.1%[29]。Yu等[30]發現NIPT對于雙胎妊娠產前篩查的準確性和特異度高達100%，更加證實了cffDNA可有效應用于多胎妊娠的產前篩查。

3 cffDNA應用于產前診斷中的優勢與局限性

3.1cffDNA在產前診斷中的優勢 傳統的有創性產前檢查方法主要通過侵入性操作對胎兒進行染色體等相關疾病的檢測，如胎兒臍帶血取樣、羊膜穿刺和絨毛膜絨毛取樣等[31]。然而，侵入性產前檢查使流產發生率升高，早產和胎膜早破等發生風險也隨之增加[6]。NIPT通過檢測孕婦外周血中cffDNA，有效避免了有創性檢查對孕婦及胎兒所造成的侵入性損害，使孕婦流產和感染的發生風險降低，而且操作更加簡便，安全性也相對較高，更易被孕婦所接受。

NIPT作為一種產前篩查方法，能夠有效檢測出染色體非整倍體疾病，對于胎兒染色體疾病的篩查和預防有著非常重要的作用，同時cffDNA與母體血清生化標志物篩查相比，具有準確率更高、假陽性率更低的特點，尤其是對于唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征這三大染色體疾病的篩查具有較高的靈敏度和準確性。Taylor-Phillips等[32]研究表明NIPT在運用孕婦外周血中cffDNA檢測胎兒染色體非整倍體疾病方面準確性高，其中唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征的診斷準確率分別高達99.3%、97.4%和97.4%。

3.2cffDNA應用于產前診斷的局限性 孕婦外周血中cffDNA對于染色體非整倍體疾病的檢測主要受到以下因素的影響：①cffDNA在孕婦外周血中含量較少，尤其是孕周小于12周時，cffDNA在孕婦外周血中的含量常低于4%，可能出現cffDNA無法檢測或者出現假陰性[12]，這也是NIPT多在妊娠12～26+6周進行的原因[33]；②cffDNA來源于胎盤DNA，而非胚胎本身DNA，同時與母體DNA存在50%的共有序列[9]，故部分假陽性或假陰性結果的出現也是不可避免；③目前cffDNA主要應用于唐氏綜合征、愛德華綜合征和帕托綜合征等染色體非整倍體疾病的篩查，準確性較高，但是篩查的染色體范圍有一定局限性，且當孕婦出現多胎、嵌合體及父母親中存在染色體異常等情況時則不適于采用cffDNA進行產前篩查。

雖然孕婦外周血中cffDNA在產前診斷中的應用存在一定的局限性，但是其作為一種產前篩查方法能夠有效檢測出染色體非整倍體疾病，對于胎兒染色體疾病的篩查和預防有著非常重要的作用，且在保證靈敏度和特異度的同時也能降低流產和感染的發生率，是一種無創、早期、安全的產前篩查方法，易被孕婦所接受，可廣泛應用于臨床產前檢測。