食管鱗狀細胞癌中環狀RNA的生物學功能與調控機制研究

胡增濤，王微娜，孫東升，關滄海，姜興明

管癌的發病率位居所有惡性腫瘤第八位，高發地區包括亞洲中部、伊朗與中國北部，按照組織學類型可分為鱗狀細胞癌和腺癌[1-2]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占我國食管癌的95%以上，位居癌癥相關死亡原因第四位[3-4]。ESCC的高病死率主要是由于疾病早期診斷率低及確診時約50%患者已發生腫瘤轉移[5-6]。臨床數據表明，ESCC晚期患者5年生存率低于20%，故早期診斷及治療能顯著改善ESCC患者預后，且術后10年生存率可達95%[7-11]。因此，尋找可行的早期篩查指標對于ESCC的診治極為重要。有研究發現，相比于正常食管組織，ESCC中環狀RNA(circular RNA, circRNA)存在顯著性差異表達，參與調控ESCC的發生、發展，并且circRNA還與ESCC放療敏感度及預后密切相關[12-17]。本文就ESCC中circRNA的生物學功能與調控機制進行闡述，為疾病的診斷與治療提供新的思路。

1 circRNA概述

在20世紀70年代，Sanger等[18]通過電子顯微鏡發現類病毒是具有共價閉合環狀結構與高熱穩定性的單鏈RNA分子，亦是研究人員首次發現circRNA。最初研究人員認為circRNA僅在少數細胞中以低水平表達，但隨著RNA測序與生物信息學技術的快速發展，科學家發現circRNA因其結構特性不受RNA外切酶作用，能夠在哺乳動物細胞中穩定、保守地表達，具有細胞表型特異性及組織和發育階段特異性[19-20]。此外，circRNA參與調控包括腫瘤在內的多種疾病的發生、發展，其主要生物學功能是充當微小RNA(miRNA)海綿、調節親本基因轉錄及作為調控性蛋白質與編碼性蛋白質相互作用的銜接子[21-23]。

2 ESCC中促癌功能circRNA

2.1CDR1反義RNA(CDR1 antisense RNA, ciRS)-7 Sang等[24]應用實時定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)對86例ESCC標本與正常標本進行檢測，發現ESCC中ciRS-7呈異常高表達，并且表達水平與病理分級和臨床分期密切相關，同時集落形成實驗、劃痕實驗及Transwell實驗均顯示ciRS-7過表達能夠促進ESCC細胞增殖、侵襲及遷移，與孟令嬌等[25]研究結果一致。此外，Sang等[24]熒光素酶實驗結果表明，ciRS-7與miR-876-5p、miR-876-5p及MAGE-A家族基因之間均存在結合位點，且外源性上調miR-876-5p表達能夠抑制腫瘤細胞增殖、降低侵襲遷移能力、下調MAGE-A家族基因的表達，而ciRS-7過表達則能逆轉上述抑制作用，同時MAGE-A家族基因表達上調能夠促進ESCC細胞增殖與遷移；動物實驗結果顯示，ciRS-7過表達能夠促進腫瘤生長并逆轉miR-876-5p對ESCC惡性進展的抑制作用；免疫組織化學染色結果顯示，miR-876-5p過表達組MAGE-A蛋白與增殖標志物的表達降低，而這種負向調控作用又受ciRS-7的抑制。

Li等[26]研究發現ciRS-7在ESCC組織中過表達，并且其表達水平可作為預后獨立影響因素。有文獻報道，ciRS-7能夠內源性海綿吸附miR-7，而miR-7與HOXB13的3'-UTR中的互補序列相結合以下調其表達水平[27-28]，且過表達miR-7能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲與遷移，誘導HOXB13表達水平顯著下調，同時miR-7的抑制作用均能通過重新引入ciRS-7來逆轉。有研究表明，NF-κB信號通路的激活參與多種腫瘤的發生、發展，并且與HOXB13促進前列腺癌細胞轉移及肺癌中ciRS-7促癌作用的發揮密切相關，同時過表達的HOXB13能夠促進ESCC中p65磷酸化[29-30]。上述研究說明ciRS-7的上調能夠消除miR-7對其下游靶基因HOXB13的抑制作用，誘導p65磷酸化，從而促進ESCC的惡性生物學行為。此外，有研究發現ciRS-7能夠通過miR-7/KLF4分子軸上調磷酸化IKK-α的表達，進而推動ESCC的惡性進展[31]。

2.2環狀RNA蛋白激酶C(circular RNA protein kinase C iota, circ-PRKCI) circ-PRKCI在ESCC中過表達，并且外源性上調circ-PRKCI表達能夠促進腫瘤細胞的增殖與遷移[32]。核質分離實驗結果表明circ-PRKCI主要位于胞質，提示circ-PRKCI可能參與介導轉錄后修飾；生物信息學預測結果顯示，circ-PRKCI能夠與miR-3680-3p結合，且miR-3680-3p在同一個位點與AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3, AKT3)存在合作關系；進一步研究發現ESCC中miR-3680-3p表達水平下降，AKT3表達水平上調，同時circ-PRKCI能夠逆轉miR-3680-3p mimics對ESCC細胞增殖、遷移及AKT3表達的抑制作用[32]。此外，Xia等[33]研究表明circ-PRKCI在ESCC中呈過表達(相比對照組平均上調8.75倍)，并且表達水平與腫瘤分化及TNM分期密切相關；CCK-8測定、集落形成實驗與Transwell實驗結果顯示，降低circ-PRKCI表達能夠顯著抑制ECA-109與TE-13腫瘤細胞的增殖與侵襲遷移能力，且利用siRNA轉染ECA-109與TE-13腫瘤細胞后能夠下調Cyclin D的表達并誘導細胞周期停滯于G2期。

2.3circRNA_100876 Cao等[34]發現circRNA_100876在ESCC中的表達水平明顯高于相鄰正常組織，并且與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及血管侵襲密切相關；動物體內成瘤實驗結果證實siRNA轉染組小鼠腫瘤體積明顯小于對照組；細胞實驗結果顯示，外源性敲除circRNA_100876能夠在體外抑制ESCC細胞的增殖、侵襲及遷移，下調上皮間充質轉化相關蛋白與轉錄因子的表達，誘導細胞周期停滯于G2/M期并促進其凋亡。

2.4其他circRNA Rong等[35]應用qRT-PCR對ESCC患者和健康者的血漿及ESCC患者腫瘤組織進行檢測，發現環狀RNA MAGUK支架蛋白1(circular RNA discs large MAGUK scaffold protein 1, circ-DLG1)表達水平顯著上調，并且與TNM分期密切相關；CCK-8測定與集落形成實驗結果表明，利用siRNA轉染circ-DLG1高表達的K180和T10細胞能夠有效抑制ESCC細胞增殖。Wang等[36]通過對ESCC患者及正常受試者血漿進行微陣列分析，發現環狀RNA四肽重復結構域17(circular RNA tetratricopeptide repeat domain 17, circ-TTC17)的差異表達最為顯著，同時ESCC中circ-TTC17呈過表達，并且其表達水平與TNM分期及淋巴結轉移密切相關；細胞實驗結果顯示，外源性下調circ-TTC17的表達水平能夠抑制腫瘤的增殖與遷移。Song等[37]研究發現hsa_circ_0000337在ESCC中的表達水平顯著上調；動物實驗結果表明外源性敲除hsa_circ_0000337能夠抑制腫瘤細胞增殖與侵襲，促進腫瘤細胞凋亡；熒光素酶實驗結果顯示，hsa_circ_0000337與miR-670-5p存在結合位點。上述研究表明circRNA在ESCC中的下游靶基因與功能蛋白尚未明確，并且具體作用機制有待深入研究。

3 ESCC中抑癌功能circRNA

3.1環狀RNA E3泛素蛋白連接酶(circular RNA itchy E3 ubiquitin protein ligase, circ-ITCH) 有研究發現，與相鄰正常組織比較，circ-ITCH在ESCC中表達水平顯著下調；皮下成瘤實驗、CCK-8測定與集落形成實驗結果表明，過表達circ-ITCH能夠在體內與體外顯著抑制腫瘤細胞的增殖；流式細胞術檢測結果顯示，circ-ITCH表達水平上調能夠誘導ESCC細胞周期停滯于G1期；對circ-ITCH作用機制進行研究，發現其通過充當“分子海綿”與相應miRNA結合，進而上調下游基因E3泛素蛋白連接酶(itchy E3 ubiquitin protein ligase, ITCH)的表達，而ITCH的過表達能夠促進蓬亂蛋白2的泛素化與降解、抑制T淋巴細胞特異轉錄因子的轉錄活性并下調腫瘤細胞中c-Myc與β-catenin的表達[38]。上述研究表明circ-ITCH通過調控Wnt/β-catenin信號傳導途徑在ESCC中發揮抗腫瘤作用。

3.2circ0043898 Wang等[39]應用轉錄組測序技術與qRT-PCR對ESCC標本織進行檢測，發現差異表達的circRNA主要參與腫瘤蛋白多糖的合成及Rap1與mTOR信號通路，其中circ0043898在腫瘤組織中的表達水平較為穩定且明顯低于正常組織；動物實驗結果證實，circ0043898過表達組腫瘤的體積更小、重量更輕；MTS測定與集落形成實驗結果顯示，應用circ0043898過表達載體轉染Kyse-520與ECA-109細胞后能夠顯著抑制其增殖能力；Transwell實驗結果表明，外源性上調circ0043898表達能抑制腫瘤細胞侵襲與遷移，并且Kyse-520與ECA-109細胞凋亡百分比分別增加2倍和4倍，同時使細胞周期停滯于G1期。

3.3環狀RNA SMAD家族成員7(circular RNA SMAD family member 7, circ-SMAD7) Zhang等[40]通過對ESCC患者及健康對照組血漿進行微陣列分析與qRT-PCR檢測，證實circ-SMAD7在ESCC中表達水平顯著下調，并且與TNM分期及淋巴結轉移呈負相關，同時ESCC腫瘤細胞系TE10和KYSE30的circ-SMAD7表達水平最低；集落形成實驗結果顯示，外源性下調E10和KYSE30細胞中circ-SMAD7的表達能夠促進腫瘤細胞增殖，而E10和KYSE30細胞內轉染circ-SMAD7過表達載體則能夠抑制腫瘤生長；傷口愈合測定實驗結果表明，circ-SMAD7表達受抑制的ESCC細胞相較于健康對照組可表現出更高的遷移率，而circ-SMAD7過表達則能夠抑制ESCC細胞遷移。

4 展望

從錯誤剪接的副產物到具有重要生物學功能的RNA分子，circRNA的功能隨著研究的深入不斷地被發掘。作為穩定、保守的非編碼RNA，circRNA可作為腫瘤診斷標志物、治療靶點及預后評估指標。目前我國ESCC發病率仍位于世界前列，ESCC中circRNA的研究對于臨床診治及預后評價具有重要意義。此外，circRNA在ESCC中的作用機制尚未闡明，其生物學功能的研究仍主要圍繞于“分子海綿”機制，相信隨著相關機制的進一步發現與闡明，circRNA有望作為新型生物學標志物在ESCC的篩查、診斷與治療中獲得更為廣泛的應用。