星形細胞上調基因-1及基質金屬蛋白酶9在腎癌中表達及臨床意義

李淑靜 顧國建 盛維新 卑占宇

(1承德護理職業學院藥學系，河北 承德 067000；蘇州大學附屬太倉醫院 2病理科；3泌尿外科)

腎癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一,病理上70%～80%為腎透明細胞癌〔1〕。其對放化、療不敏感，手術是首選治療方案〔2〕。但因為其起病隱匿,癥狀不明顯,診斷時多達三分之一的腎透明細胞癌患者已經侵襲其他鄰近組織或轉移到遠處,約一半的病人會術后復發,預后較差,嚴重威脅患者生命健康〔3〕。目前研究發現多種基因表達異常與腫瘤侵襲、轉移密切相關,其中星形細胞上調基因(AEG)-1及基質金屬蛋白酶(MMP)9與其關系密切。本文采用Western印跡法及免疫組化方法檢測腎癌及癌旁組織中AEG-1及MMP9蛋白的表達,并探討其臨床意義及相互聯系。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集蘇州大學附屬太倉醫院泌尿外科2017年1～12月手術切除的腎癌及距癌灶3 cm以上的癌旁新鮮組織各15例。每例取一部分組織放置在液氮中，另一部分組織制成石蠟標本保存。另從病理科收集2013年1月至2016年12月手術切除的66例腎癌石蠟標本。所選患者手術前未接受放療、免疫或化療。共81例石蠟標本，病理類型全部為腎透明細胞癌，其中男52例,女29例,年齡23～75歲,平均58.7歲。根據2010年美國聯合癌癥委員會(AJCC)腎癌臨床分期:Ⅰ期25例,Ⅱ期29例,Ⅲ期20例,Ⅳ期7例,病理上采用Fuhrman 分級:其中G1期35例,G2期22例,G3期24例。門診或電話隨訪3～60個月。

1.2試驗方法

1.2.1Western印跡檢測腎癌及癌旁組織中AEG-1及MMP9的表達 取出保存于液氮中的腎癌與癌旁組織標本，切取 100 mg組織放入研缽，置于冰上，迅速研磨成粉；添加含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細胞(碧云天公司),離心，提取蛋白，沸水加熱3～5 min，使蛋白充分變性，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙酰胺凝膠電泳(PAGE),然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，3%牛血清白蛋白(BSA)阻斷后1 h,膜與一抗(AEG-1或MMP9 或β-actin 1∶1 000)4℃過夜,洗膜,添加二抗(1∶8 000),搖床搖動1 h,隨后TBST洗膜,加發光液,曝光成像,β-actin 作為蛋白質負荷計量。

1.2.2鏈霉卵白素-過氧化物酶(S-P)免疫組化染色法 實驗中所用一抗兔抗人AEG-1單克隆抗體(1∶150)從 Zymed Laboratories公司購買,兔抗人MMP9單克隆抗體(1∶100)、SP免疫組化試劑盒購于福州邁新生物公司。將標本連續4 μm切片，再脫蠟、水化后,每個標本行蘇木素-伊紅(HE)和SP免疫組化染色,操作過程參見相關文獻〔4,5〕。AEG-1和MMP9以腫瘤細胞質著色為陽性細胞,由兩位病理科醫師結合染色細胞所占百分比和染色強度做出判斷。按陽性細胞所占腫瘤細胞的百分比評分:0分(無染色細胞),1分(<10%),2分(10%～50%),3分(>50%),再按顯色程度計分:0分(無染色細胞),1分(細胞被染淺黃色),2分(棕黃色),3分(棕褐色)，兩者相加≥3分為陽性,0～2分為陰性〔5〕。

1.3統計學方法 采用SAS9.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。應用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank 檢驗進行生存分析。

2 結 果

2.1AEG-1和MMP9在腎癌及癌旁腎組織中的表達 Western印跡檢測結果提示，AEG-1 在15 例腎癌組織、癌旁腎組織中的相對值分別為(0.606±0.079)、(0.112±0.041)，腎癌組織中AEG-1蛋白 表達明顯高于癌旁腎組織(P<0.001)；MMP9 在腎癌組織中的表達(0.622±0.085)也顯著高于癌旁腎組織(0.179±0.078，P<0.001)，見圖1。免疫組織化學法結果顯示，AEG-1和MMP9陽性物質位于細胞質,陽性細胞為細胞質被染成棕黃色，其中，癌組織AEG-1陽性49例(60.5%)、陰性32例(39.5%)，MMP9陽性51例(63.0%)，陽性30例(37.0%)；癌旁組織AEG-1陽性2例(13.3%)，陰性13例(86.7%)，MMP9陽性3例(20.0%)，陽性12例(80.0%)。兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖1 AEG-1和MMP9在腎癌及癌旁組織中的表達

圖2 AEG-1和MMP9在腎癌組織中的染色結果(DAB,×200)

2.2AEG-1及MMP9與腎癌病理、臨床特征的關系 AEG-1及MMP9蛋白表達增高與腎癌的病理分級、淋巴結轉移、臨床分期密切相關(P<0.05);而與患者性別、年齡、腫瘤大小無顯著相關性(P>0.05)，見表1。

表1 AEG-1及MMP9表達的影響因素〔n(%)〕

2.3腎癌組織中AEG-1與MMP9的相關性分析 腎癌組織中，AEG-1與MMP9同陽性41例，同陰性22例，AEG-1陽性、MMP9陰性8例，AEG-1陰性、MMP9陽性10例，AEG-1與MMP9蛋白表達呈正相關(r=0.531,P<0.001)。

2.4AEG-1和MMP9 與腎癌生存的相關分析 在腎癌組織中，AEG-1蛋白高表達的患者與低表達的患者相比，總生存較差(P=0.005),MMP9蛋白高表達的患者與低表達的患者相比，總生存較差(P=0.018),見圖3。

圖3 基于AEG-1和MMP9表達的腎癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

2002年,Su等〔6〕發現在人胚胎初級星形細胞被人類免疫缺陷病毒(HIV)感染后,有15個基因表達增高,稱為星形細胞上調基因(AEGs),其家族成員的中的AEG-1位于人染色體8q22。多項研究發現,AEG-1在膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、視網膜母細胞瘤等惡性腫瘤組織高表達,它可以抑制細胞的凋亡,促進腫瘤血管生成、細胞增殖、侵襲、轉移等〔5,7～9〕。

本研究中,Western印跡及免疫組織化學結果提示：AEG-1蛋白在腎癌細胞中的陽性率明顯高于癌旁腎組織。其中，發生淋巴結轉移的患者,AEG-1表達相對增高,AEG-1蛋白其表達水平隨病理分級增加而增加,并隨著臨床分期增加而增加,提示AEG-1與腎癌發生、發展中起一定的作用,可用于腎癌的輔助診斷。本文隨訪結果提示,與AEG-1蛋白陰性患者相比，陽性患者生存時間短,預后不良。這與其他組織腫瘤的預后相似〔10〕。綜上，AEG-1蛋白是很好的判斷患者預后的指標。隨著分子生物學技術的發展,Chang等〔9〕和Zhang等〔11〕等學者將腫瘤細胞中AEG-1進行基因沉默,結果發現腫瘤細胞增殖、遷徙和侵襲能力明顯下降,這些研究表明AEG-1是潛在的腫瘤基因治療的靶點。

MMP家族可以通過降解細胞外基質,進而促進腫瘤細胞侵襲、轉移〔12,13〕。MMP9在多種腫瘤組織中高表達,而且與MMP9陰性患者相比，MMP9陽性患者預后不良〔14〕。Western印跡及免疫組織化學結果提示： MMP9蛋白在腎癌細胞中的陽性率明顯高于癌旁組織,發生淋巴結轉移的患者,MMP9表達相對增高,其表達水平隨病理分級增加而增加,并隨著臨床分期增加而增加,提示MMP9在腎癌發生、發展中起一定的作用。Log-Rank檢驗顯示與陰性患者相比，陽性患者預后不良,這與在其他腫瘤組織中的研究相符合〔15〕,提示其可考慮用于腎癌的輔助診斷,及判斷患者預后。

本研究發現,腎癌組織中AEG-1蛋白升高,而MMP9表達也相應升高,二者正相關。有學者研究發現,AEG-1可通過MMP9途徑促進腫瘤細胞侵襲和遷移〔15〕。本研究顯示,AEG-1基因可能通過MMP9途徑促進腫瘤細胞遷移和轉移。

綜上所述,在腎癌發生發展中,AEG-1及MMP9可能起一定作用,聯合檢測AEG-1及MMP9有助于腎癌的輔助診斷和判斷患者的預后,對其進一步研究,有望成為腎癌基因治療的新靶點。