p16和Ki67在宮頸癌癌前病變及宮頸癌中表達及其與HPV感染的相關性

何旻 謝南子 陳觀美 程其會 宋紅梅

(安順市人民醫院，貴州 安順 561000)

子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤疾病，在全部女性惡性腫瘤疾病中發病率僅次于乳腺癌，居第二位〔1〕。高危人乳頭瘤狀病毒(HPV)持續感染被認為與宮頸癌發生、發展相關，宮頸在受到HPV持續感染后，可以通過與之相關的基因產物干擾正常細胞周期的調節，進而引起細胞連續增殖及惡性轉化〔2,3〕。目前，細胞學篩查與HPV檢測是我國宮頸癌主要的篩查手段，但二者均受主觀、客觀等因素影響，特異性較低，應用受到限制〔4〕。故積極找到一種與宮頸病變程度、HPV感染情況相關的客觀指標極為必要。p16是細胞周期依賴性激酶抑制蛋白，是一種新型抑癌基因，能夠直接對細胞周期的紊亂產生抑制，介導細胞的無限制增生，甚至是癌變，被用于諸多惡性腫瘤細胞增殖、轉移的評估中〔5,6〕。Ki67是增殖性細胞合抗原，僅在細胞增殖周期的G1、G2、S、M期有表達，而在G0期表達缺失，也被用于諸如肺腺癌等惡性腫瘤預后評估中〔7〕。若同一組織中同時存在p16與Ki67表達則提示高級別病變可能，該機制為區分潛在高級別宮頸病變提供了客觀性依據，但目前將二者用于宮頸病變篩查的相關研究并不多見。本研究主要觀察老年宮頸癌前病變及宮頸癌患者p16、Ki67表達及HPV感染情況，分析p16、Ki67與HPV感染的相關性，旨在找到能夠區分潛在高級別宮頸病變的客觀性指標，以指導臨床。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集并分析安順市人民醫院2017年3月至2019年3月經刮診或手術病理證實的宮頸癌前病變老年患者100例作為宮頸癌前病變組，同期經刮診或手術病理證實的宮頸癌老年患者60例作為宮頸癌組，同期在院接受治療的宮頸炎患者60例作為宮頸炎組。宮頸癌前病變組年齡60～85〔平均(73.24±5.21)〕歲；體重44～78〔平均(60.24±11.21)〕kg。宮頸癌組年齡60～84〔平均(72.69±5.19)〕歲；體重45～78〔平均(61.04±11.17)〕kg。宮頸炎組年齡60～85〔平均(73.36±5.32)〕歲；體重45～79〔平均(61.78±12.01)〕kg。3組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，有可比性。

1.2入選標準 (1)納入標準：①臨床資料完整者；②宮頸癌前病變及宮頸癌組均經宮頸刮診或手術病理確診；③既往均無宮頸物理治療史及手術治療史；④年齡≥60歲；⑤宮頸炎患者經查無惡性病變，為單純的宮頸炎。(2)排除標準：①既往接受宮頸物理治療或手術治療者；②既往接受化療、放射治療者；③合并其他惡性腫瘤疾病者；④合并其他心、肝、腎等重要臟器衰竭或不全者；⑤合并其他可能對p16、Ki67等檢查結果有影響的疾病者。

1.3方法 全部入組者均采用免疫組織化學染色法測定其p16、Ki67表達，同時給予宮頸刮診實施TCT檢查，以判斷HPV感染情況。

1.3.1免疫組織化學染色法 免疫組織化學染色法試劑盒由福州邁新公司提供，參照試劑盒具體說明書進行操作〔8〕。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，石蠟切片后脫蠟水化，后經微波抗原修復，使用過氧化酶阻斷劑對內源性過氧化物酶活性滅活后，采用羊血清工作液封閉，并向內滴加一抗，置于4℃的條件下過夜，向內滴加經過生物素標記的二抗，同時向內滴加過氧化物酶溶液，經DAB顯色后使用蘇木素復染，將已經明確陽性的組織切片作為陽性對照，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗用作陰性對照。結果判讀：p16陽性表達于細胞質或細胞核上，以出現棕黃色或黃色顆粒為陽性。Ki67陽性表達于細胞核上，以棕黃色顆粒為陽性。陽性細胞數與技術細胞總數之比為陽性百分率。P16陽性細胞數低于5%則判定為陰性，細胞數5%～25%定義為弱陽性(+)，細胞數26%～75%則定義為中等陽性()，細胞數>75%則定義為強陽性。Ki67陽性表達在上皮基底層定義為陰性(-)，表達超出基底層的10%～25%定義為弱陽性(+)，表達超出基底層的26%～75%定義為中等陽性()，表達超出極低層超過75%為強陽性()。

1.3.2宮頸學細胞檢測 使用一次性宮頸細胞采樣刷，指導患者仰臥于檢查床上，將檢查刷置于子宮頸內，取病灶部位少量標本，在保存液內將收集來的病變組織仔細清洗，并制片，由具有豐富閱片經驗的專業細胞學醫師進行閱片，參照子宮頸細胞學TBS標準進行閱片并判定其感染情況〔9〕。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關性檢驗。

2 結 果

2.13組p16、Ki67蛋白陽性率比較 3組中，宮頸炎組p16、Ki67蛋白陽性率最低，其次為宮頸癌前病變組，宮頸癌組患者陽性率最高，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組p16、Ki67蛋白陽性率比較〔n(%)〕

與宮頸炎組比較:1)P<0.05；與宮頸癌前病變組比較:2)P<0.05

2.23組HPV感染率比較 3組中，宮頸炎組HPV感染率最低〔15.00%(9/60)〕，其次為宮頸癌前病變組〔90.00(90/100)〕，宮頸癌組感染率最高〔100.00%(100/100)〕，組間比較差異有統計學意義(χ2=136.913,P<0.001)。

2.3p16、Ki67表達與宮頸癌前病變/宮頸癌患者HPV感染相關性 p16、Ki67與宮頸癌前病變患者及宮頸癌患者HPV感染均呈正相關(r=0.744，0.561，均P<0.001)。

3 討 論

在我國多數地區及基層醫院宮頸癌的篩查手段仍以細胞學檢測為主，但多年的實踐研究發現，細胞學檢測存在準確性差、靈敏度低下、特異度低下、質量控制不佳等諸多問題〔10〕。為了提高各偏遠地區及基層醫院宮頸癌前病變的篩查與診斷率，需盡快找到一種合理且準確的篩查技術。就現有的研究來看，生物學指標用于宮頸癌前病變與宮頸癌的診斷具有重要的應用價值〔11〕。相較于細胞學診斷，分子生物學標志物的應用，諸如p16、Ki67等，其采用的免疫組織化學染色技術的結果判定并非完全依賴細胞形態學，相對而言，其對醫生的技術要求更為簡單，只需對醫生進行必要的閱片培訓便可判定〔12〕。

本研究主要對p16、Ki67兩種生物學標志物用于宮頸癌前病變及宮頸癌HPV感染預測的價值進行觀察分析。p16對應的p16iKN4A基因位于第9號染色體短臂第2區1帶，是最近幾年發現的繼p53基因后又一個重要的抑制基因，屬于INK4A家族成員之一，是cyclin-CDK復合物特異性抑制劑，可直接作為細胞周期調控分子開關，幾乎是全部惡性腫瘤常見的分子事件〔13〕。此外，p16還是近幾年研究出的第一個可直接對細胞增殖周期進行調控的抑癌基因〔14〕。在正常的上皮內p16表達極弱甚至不表達，但在腫瘤組織內p16表達則明顯增強。本研究顯示，隨著宮頸病變級別、惡性程度增加，p16表達強度也隨之升高，這與劉峰等〔15〕研究結果相符。經上述結果可以推測，在宮頸上皮癌前病變向癌發展期間p16高表達可能起到關鍵的促進作用。

Ki67是細胞增生相關蛋白的一種，可能參與了細胞周期蛋白的調控，與細胞周期蛋白聯系密切，至今臨床一直未停止對Ki67蛋白的機制及具體功能進行研究，然而針對該蛋白的具體機制及主要功能仍未完全明確，但現有的研究已經證實，該蛋白可以用在日常病理工作實施中，可作為腫瘤細胞主要的增殖標志物〔16〕。Ki67屬于增殖細胞核抗原，因其半衰期短，且陽性表達幾乎覆蓋了整個有絲分裂周期，故能夠很直觀地反映出細胞增殖活性〔17〕。Ki67蛋白在正常上皮內無表達，只有當上皮出現病變或發生腫瘤疾病時，其表達才會增強，且隨著病變程度與惡性程度呈逐漸增強的趨勢。本研究結果顯示，Ki67可能參與了宮頸癌前病變、宮頸癌等疾病的發生與發展過程中。

HPV持續感染是被首先提出的一個宮頸癌病因假說，隨著研究的深入，國內外醫學專家對HPV結構、生物學特性、功能及致癌機制等均展開了大量的研究，從基因水平及分子學方面對其與宮頸癌之間存在的關系進行深入研究認為，HPV是引起宮頸癌發生發展的獨立危險因素〔18〕。HPV感染檢測是早期篩查并發現宮頸癌前病變與宮頸癌的有效手段，可見若要進一步分析各生物學標志物與宮頸癌的相關性，可首先分析各生物學標志物表達與患者HPV感染的相關性，來間接評價其與宮頸癌的關系。本研究結果顯示，宮頸癌前病變與宮頸癌患者p16、Ki67蛋白呈高表達，且與患者HPV感染明顯相關，隨著p16、Ki67蛋白表達升高，患者感染HPV風險增加，未來可考慮將p16、Ki67蛋白的動態監測結果作為宮頸癌前病變及宮頸癌早期篩查與診斷的主要生物學標志。