高壓氧對老年腦缺血大鼠血清心型脂肪酸結(jié)合蛋白含量的影響及機制

郭知偉 陳玉軍 王寶慶 張金浩 姜建強

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

多源性小細胞是脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的主要組成成分，腦部組織中主要包括心型FABP(hFABP)及腦型FABP兩種，在腦梗死等嚴重的心血管疾病發(fā)生的過程中常常伴隨神經(jīng)細胞的損傷甚至死亡，細胞內(nèi)hFABP釋放入血引起血清中含量升高。研究表明，在缺血后再灌注的發(fā)生過程中常常伴隨結(jié)合蛋白含量的改變〔1〕，本文探究缺血再灌注過程損傷與蛋白含量改變之間的相關(guān)性，分析高壓氧(HBO)對老年腦缺血大鼠血清hFABP含量的影響及機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 購自上海實驗動物有限公司的老年大鼠180只，納入標準：(1)均統(tǒng)一采購，經(jīng)專門企業(yè)培養(yǎng)；(2)生活環(huán)境及飲食條件完全相同。排除標準：(1)體重嚴重偏離平均體重；(2)伴有病菌感染等疾病〔2〕。隨機分為研究組和對照組，研究組90只，其中雌性45只，雄性45只，月齡19～21個月，平均月齡(20.5±0.2)個月；對照組90只，雌性43只，雄性47只，月齡19～22個月，平均月齡(20.7±0.3)個月，兩組一般資料差異不存在統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2血清hFABP含量檢測 分別于兩組大鼠接受HBO治療前后抽取其空腹血液，樣本抽取結(jié)束保存在加有抗凝劑的無菌管中，血量為5 ml，隨后在1 500 r/min的條件下進行離心并將血清保存于-80℃的條件下備用，應用hFABP試劑盒(上海恒遠有限公司)進行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，操作過程嚴格按照說明書進行〔3〕。

1.3腦組織小窩蛋白-2及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2檢測 測定均通過免疫印跡法，具體為：首先對大鼠進行深度麻醉，用低溫下的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行心臟灌流，隨后選取缺血再灌注段的腦組織微血管并采用裂解液制作勻漿，隨后在4℃、轉(zhuǎn)速為15 000 r/min的條件離心并對上清液進行蛋白測定，蛋白測定的方法為考馬斯亮藍G-250結(jié)合定量法〔4〕。具體操作為在體積分數(shù)為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離不同分子質(zhì)量及電荷量的蛋白質(zhì)，隨后將不同條帶轉(zhuǎn)移至分別含有腦組織小窩蛋白-2及MMP-2抗體的硝酸纖維素薄膜上孵育過夜，在計算機軟件下進行蛋白分離結(jié)果的掃描，根據(jù)條帶的光密度值測定其含量〔5〕。

1.4血腦屏障(BBB)通透性檢測 通過伊文思蘭測定腦組織，具體操作嚴格按照說明書進行〔6〕。

1.5再灌注模型建立 再灌注模型的建立方法為大腦中動脈線栓法，具體為：使用10%的水合氯醛進行腹腔注射以麻醉大鼠〔7〕。麻醉成功后切開其左側(cè)頸部使頸總動脈充分暴露，最后使用剝離分針分離此處的迷走神經(jīng)，分離結(jié)束后進行翼腭動脈及頸外動脈的結(jié)扎，隨后借助末端較為圓潤的尼龍絲分別經(jīng)過頸外動脈及頸內(nèi)動脈置入大腦前部的交通動脈內(nèi)，插入深度為120～200 cm，具體的深度根據(jù)大鼠的體重及頭部體積等具體調(diào)整，插入后即達到阻塞大腦動脈右側(cè)血液供應的目的，堵塞時間為2 h左右，拔出尼龍線即完成再灌注模型的建立〔8〕。

1.6腦梗死體積測定 大鼠接受HBO治療后采用頸部折斷法處死并采集腦組織，隨后制成厚度為2 mm左右的切片〔9〕。將切片置于1.2%的氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液中，在37℃的條件下恒溫保存30 min，分別置于藍色背景中進行拍照并利用HPIAS-1000圖像分析系統(tǒng)測量計算梗死體積百分比〔10〕。

1.7再灌注過程死亡率及腦組織損傷率發(fā)生 腦組織損傷率通過梗死體積的變化進行衡量，損傷率=腦梗死面積增大只數(shù)/總只數(shù)〔11，12〕。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組治療前后血清hFABP含量比較 治療后研究組血清hFABP含量明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組治療前后血清hFABP含量對比

與治療前比較：1)P<0.05，表2、表3同

2.2兩組腦組織小窩蛋白-2及MMP-2表達對比 治療后研究組腦組織小窩蛋白-2、MMP-2表達明顯高于對照組(P<0.05)，見表2和圖1。

表2 兩組相關(guān)蛋白表達對比

1.對照組治療前；2.研究組治療前；3.對照組治療后；4.研究組治療后圖1 治療前后兩組腦組織小窩蛋白-2、MMP-2表達

2.3兩組BBB通透率對比 治療后研究組BBB通透率明顯小于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組BBB通透率對比

2.4再灌注過程中兩組死亡率對比 研究組再灌注死亡率〔13只(14.4%)〕明顯小于對照組〔21只(23.3%)，χ2=4.892,P<0.05〕。

2.5再灌注過程兩組腦組織損傷率對比 研究組腦組織損傷率明顯低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 再灌注過程中兩組腦組織損傷率對比〔n(%),n=90〕

3 討 論

疾病的早發(fā)現(xiàn)早治療能夠明顯優(yōu)化患者的疾病治療效果，提高生存率〔13〕。對于腦梗死等惡性疾病可以通過血管的疏通協(xié)調(diào)全身的血液流動狀況，但是在搶救過程中的再灌注損傷率使疾病的治療效果大大下降，因此做好疾病治療的監(jiān)控工作，可有效避免再灌注給患者生命健康帶來的威脅〔14〕。本研究結(jié)果說明HBO治療能夠通過減少患者的腦梗死面積，提高機體血液的流通程度優(yōu)化疾病治療效果。

研究表明，HBO能夠大大降低BBB通透性，進一步引起腦部血流量的下降，減少腦組織內(nèi)對于水分的吸收，防止腦部組織在高滲環(huán)境下出現(xiàn)腦水腫〔15〕。本研究結(jié)果說明HBO進行再灌注過程中的機制是改變BBB之間的通透性，維持正常的滲透壓平衡。毛細血管內(nèi)皮細胞、基膜及星形膠質(zhì)細胞的突觸是BBB的主要組成成分，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外界環(huán)境之間的重要屏障。BBB的功能下降甚至喪失是腦缺血再灌注損傷發(fā)生時的主要病理學基礎(chǔ)，經(jīng)典的跨膜轉(zhuǎn)運是細胞質(zhì)膜微囊介導的主要途徑，腦組織蛋白也是腦內(nèi)參與物質(zhì)及信息傳遞的重要物質(zhì)，參與多類心血管疾病的發(fā)生過程〔16〕。

hFABP屬于脂肪酸家族的成員之一，是FABP3 基因的重要表達產(chǎn)物，心肌細胞是其主要分布的部位，在細胞質(zhì)中所占的比重為10%左右，是脂肪酸轉(zhuǎn)運過程的重要參與者，機體任何組織出現(xiàn)缺血損傷后會伴隨此類蛋白血清含量的異常升高。本研究結(jié)果說明，應用HBO進行輔助治療能夠明顯改善組織及細胞的供氧能力，最大程度減少細胞凋亡的發(fā)生概率，改善血清hFABP水平。MMP-2廣泛分布于機體的各類細胞和組織中，其含量與患者缺血時間之間存在較大的相關(guān)性，研究表明正常腦組織中此類蛋白表達量極低甚至無表達〔17〕。本研究結(jié)果說明，HBO能夠通過改善機體MMP-9含量及活性減少再灌注過程中的損傷。

綜上，在大鼠腦缺血再灌注過程中會伴隨體內(nèi)hFABP含量升高，但在再灌注過程中輔助HBO治療能夠明顯減少再灌注過程中的損傷，降低死亡率，利于臨床上的再灌注診斷及再灌注損傷情況的監(jiān)控，通過動物模型的建立能夠為臨床心血管疾病的診斷及監(jiān)控治療提供建設(shè)性建議，可行性較高。