干細(xì)胞用于慢性阻塞性肺疾病治療的研究進(jìn)展

彭京蘭 馬暢 吳曉梅

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)具有較高的發(fā)病率和死亡率，預(yù)計(jì)到2020年將成為全球疾病死亡率的第三大原因[1]，其現(xiàn)行治療方案旨在緩解癥狀，避免急性加重，提高患者的生活質(zhì)量，但不能阻止其進(jìn)展或修復(fù)受損肺組織及功能，無法降低該疾病的死亡率。因此，迫切需要研究針對(duì)COPD新的治療方法以解決此難題。

肺是由40多種不同的分化類型細(xì)胞組成的復(fù)雜器官，不同的祖細(xì)胞群位于成年人類肺的不同解剖區(qū)域(例如肺上皮干細(xì)胞)。通過動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組織特異性干細(xì)胞和骨髓來源干細(xì)胞能夠促進(jìn)受損傷的肺再生新的肺組織。這提示我們，通過給予外源性干/祖細(xì)胞或激活內(nèi)源性干/祖細(xì)胞來達(dá)到治療COPD的目的，是一種新的可行的治療方案[2]。

呼吸系統(tǒng)的內(nèi)源性干細(xì)胞種群

一、大氣道干細(xì)胞的作用

肺內(nèi)氣管和左、右主支氣管內(nèi)的假復(fù)層上皮中，含有基底細(xì)胞，屬于未分化的干細(xì)胞，在其表面表達(dá)CD44、CD49f、CD151、CD166、神經(jīng)生長因子受體(NGFR)、表皮生長因子受體(EGFR，參與組織修復(fù)的調(diào)控)，并且在其胞質(zhì)中表達(dá)細(xì)胞骨架細(xì)胞角蛋白CK5，CK14和CK17，組織因子(TF)及其胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中的蛋白 Trp-63(p63)。p63是p53家族的轉(zhuǎn)錄因子。p63能夠拮抗 p53的功能，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，以保證基礎(chǔ)細(xì)胞的存活和更新[3]。研究表明在人支氣管基底細(xì)胞中敲除 p63 會(huì)顯著降低其增殖和遷移[4]。

從功能上講，人氣管支氣管上皮的基底細(xì)胞就是干細(xì)胞，因?yàn)槠湓隗w內(nèi)(異種移植)和體外均可重構(gòu)成完全分化的黏膜纖毛上皮。有實(shí)驗(yàn)證明，將人支氣管基底細(xì)胞移植到被萘損傷了氣管及支氣管的小鼠模型中，產(chǎn)生了完全分化的上皮[5]。人體內(nèi)的滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2(TROP2)是在許多癌癥中高度表達(dá)的跨膜糖蛋白，具有干細(xì)胞樣特性，為細(xì)胞存活和增殖提供了信號(hào)[6]，在吸煙患者中觀察到，在TROP2作用下，基底細(xì)胞增殖率明顯升高[7]，因此我們推測(cè)，或許可以通過TROP2促進(jìn)氣管、支氣管基底細(xì)胞的分化再生這一方式來達(dá)到治療COPD的目的。

有研究發(fā)現(xiàn)通過支氣管內(nèi)活檢在COPD 患者的次級(jí)支氣管中獲得的支氣管基底細(xì)胞數(shù)目(CK5+/CK14+/p63+)顯著減少；而已確定為非 COPD的既往為吸煙者和/或現(xiàn)在為吸煙者的人群，他們的支氣管中的基底干細(xì)胞計(jì)數(shù)較低，并伴有氣流受限的臨床特征。這可能代表了COPD 的早期診斷前階段，表明基底干細(xì)胞衰竭與 COPD 發(fā)病機(jī)制有關(guān)[8-10]。

二、黏膜下支氣管干細(xì)胞的作用

人氣道黏膜下支氣管腺的導(dǎo)管細(xì)胞也同大氣道干細(xì)胞一樣通過在表面表達(dá) CK5，CK14，p63 等而具備了干細(xì)胞的分化特性。有研究人員發(fā)現(xiàn)，將人黏膜下支氣管腺的導(dǎo)管細(xì)胞異種移植到大鼠氣管中會(huì)產(chǎn)生許多具有不同分化能力的細(xì)胞，包括腺細(xì)胞[11]。已有實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驈娜说臍夤苤蟹蛛x出這種導(dǎo)管腺干細(xì)胞(CD166+/CD44/NGFR)[12]，另外，Swatek AM等人從肺移植所致閉塞性細(xì)支氣管炎患者的尸檢肺標(biāo)本中獲得了與導(dǎo)管腺干細(xì)胞相似類型的細(xì)胞(p63+，CK5+，CK14+)，并發(fā)現(xiàn)這些干細(xì)胞的增殖能力隨著疾病的進(jìn)展而下降，表明氣道黏膜下干細(xì)胞的衰竭可能是肺衰竭的一種機(jī)制[13]。這提示我們導(dǎo)管腺細(xì)胞或可在損傷的肺組織中起到修復(fù)作用，但目前尚未有學(xué)者在 COPD 和/或肺氣腫患者中對(duì)這類細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究。

三、支氣管肺泡干細(xì)胞的作用

在肺中，支氣管肺泡干細(xì)胞(BASCs)僅在支氣管肺泡導(dǎo)管連接處發(fā)現(xiàn)，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，但在肺損傷時(shí)會(huì)發(fā)生反應(yīng)性增殖。BASCs的細(xì)胞表面標(biāo)志物包括：2型肺泡上皮細(xì)胞表面活性劑蛋白C(SP-C)和波形蛋白[14]、血紅蛋白家族1A成員1(SCGB1A1)、干細(xì)胞抗原1(Sca-1)、CD34等。在體外將BASCs與來自人體肺內(nèi)的成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)再生出了新的支氣管肺泡結(jié)構(gòu)[14]。肺的遠(yuǎn)端氣道壁中也存在干細(xì)胞，將其移植到小鼠的受損肺中，表現(xiàn)出自我更新能力，分化出了內(nèi)胚層來源(上皮細(xì)胞)和中胚層來源(血管)的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步產(chǎn)生了人細(xì)支氣管、肺泡、血管等組織結(jié)構(gòu)，并部分恢復(fù)了小鼠的肺實(shí)質(zhì)[2]，雖然這類干細(xì)胞能夠修復(fù)小鼠受損肺組織，但目前尚未有關(guān)于在COPD患者中的臨床研究。

四、肺泡干細(xì)胞的作用

研究人員在小鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肺泡上皮2型細(xì)胞(AT2)表面能夠表達(dá)axin-2(這是一種調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定性的蛋白，具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和譜系特異性分化的作用)，并顯示出了和干細(xì)胞相同的特征[15-17]，包括自我更新能力和分化為肺泡1型細(xì)胞(AT1 細(xì)胞)的能力[16]。另外，在AT2細(xì)胞表面還可發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞粘附分子、足突細(xì)胞面膜蛋白(podoplanin，一種屬于黏蛋白型蛋白的小膜糖蛋白，是肺發(fā)育特別是肺泡型成熟所必需的)等。敲除小鼠端粒酶后，AT2細(xì)胞減少，隨之出現(xiàn)肺泡數(shù)目減少[18]，這提示AT2與肺泡的生成息息相關(guān)。肺組織中存在一種常駐肺泡干細(xì)胞，能夠表達(dá)類似于人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)細(xì)胞表面標(biāo)志物，并且在體外具有克隆能力，可以分化為AT2細(xì)胞，這些細(xì)胞僅位于肺泡壁中。在體外實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)全反式維甲酸處理的人肺泡上皮干細(xì)胞，可以進(jìn)一步分化為AT1和AT2 細(xì)胞，用Am80(合成類維生素A)刺激人的肺泡干細(xì)胞也促進(jìn)了其分化[19]。另外發(fā)現(xiàn)磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶 B(Akt)途徑也參與了人肺泡干細(xì)胞的分化，主要作用機(jī)制是通過生長因子的作用進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予相應(yīng)的抑制劑，阻斷Akt磷酸化的PI3K 途徑時(shí)，可以誘導(dǎo)肺泡上皮干細(xì)胞分化為AT1和AT2細(xì)胞[20]。此外，在由彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫的小鼠模型中，肺的Akt 磷酸化增強(qiáng)，使用PI3K抑制劑會(huì)導(dǎo)致肺泡干細(xì)胞分化[21]。

五、 肺組織間充質(zhì)干細(xì)胞的作用

肺組織中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，其分泌的FGF-10(成纖維細(xì)胞生長因子10)，可以調(diào)節(jié)發(fā)育中的肺細(xì)胞分化所必需的 BMP、Wnt 和Shh信號(hào)途徑，研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)時(shí)，給予堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF) 或肝細(xì)胞生長因子(HGF)，肺間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出了一定的克隆性[22]。在同一環(huán)境內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，肺間充質(zhì)干細(xì)胞還能夠促進(jìn)氣道上皮干細(xì)胞的增殖和分化。這些特性或可應(yīng)用于COPD的治療，但尚未有相關(guān)臨床研究。

外源性干細(xì)胞種群的作用

目前有部分學(xué)者對(duì)外源性間充質(zhì)干細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、羊水間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等)治療COPD的有效性進(jìn)行了深入的研究[23-25]。臨床前研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以通過抗炎，免疫調(diào)節(jié)，旁分泌和組織修復(fù)作用以及促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞增殖等途徑參與糾正COPD造成的肺損傷。

一、 抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用

人們對(duì)MSCs的抗炎作用在體外進(jìn)行了廣泛研究[26]。這些研究包括MSCs對(duì)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞的影響，以及對(duì)蛋白酶和蛋白酶抑制劑之間平衡的調(diào)節(jié)。MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用包括抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞和T細(xì)胞并使單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞更傾向于表現(xiàn)為抗炎和耐受性表型。主要作用機(jī)制包括以下三種：(1)細(xì)胞之間的直接接觸(例如通過 MSCs和T細(xì)胞相互作用的程序性死亡-1)(2)可以表達(dá)吲哚胺2，3-雙加氧酶和促炎性介質(zhì)環(huán)氧合酶2(COX2)，進(jìn)而介導(dǎo)前列腺素 E2(PGE2)引起氨基酸和脂質(zhì)代謝發(fā)生改變。(3)能夠產(chǎn)生PGE2和分泌因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和肝細(xì)胞生長因子。最近的數(shù)據(jù)表明，巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的MSCs，并隨后極化為另一種巨噬細(xì)胞表型，有助于其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[27-28]。有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有誘導(dǎo)彈性蛋白酶處理的肺上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞蛋白酶抑制劑的作用，從而使上皮細(xì)胞分泌表皮生長因子(EGF)和HGF。蛋白酶抑制劑能夠阻斷蛋白酶介導(dǎo)的組織損傷，降低保護(hù)性介質(zhì)的降解。使用香煙煙霧提取物(CSE)對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理，把處理后的巨噬細(xì)胞與MSCs進(jìn)行共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs增加了巨噬細(xì)胞的活力并降低COX2，白介素(IL)-6等炎癥相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)，并分泌誘導(dǎo)了抗炎細(xì)胞因子 IL-10[29]。總體而言，MSCs的這些特性可能對(duì)COPD有益。

二、 抗菌作用

MSCs不但具有抗炎作用而且能夠抗微生物[30]。其中包括通過激活其他炎癥細(xì)胞分泌免疫介質(zhì)以間接發(fā)揮作用，以及直接抑制作用。有實(shí)驗(yàn)表明，在MSCs和MSCs衍生的條件培養(yǎng)基中，常見的幾種呼吸道病原體(如銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等)的生長速率和存活率明顯降低，可能是由于MSCs能夠分泌抗菌肽和免疫介質(zhì)(例如 IL-6，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，IL-8和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子)[30]。這些因子能夠促使中性粒細(xì)胞聚集并提高中性粒細(xì)胞的抗菌活性。因此，MSCs的直接和間接作用都可能有助于宿主對(duì)入侵病原體的防御反應(yīng)，這可能與預(yù)防或治療 COPD 急性加重有關(guān)。

三、 旁分泌效應(yīng)

MSCs經(jīng)旁分泌途徑，參與調(diào)解生長因子的分泌，進(jìn)而影響肺組織細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等的再生[31]。 有研究表明給予COPD患者M(jìn)SCs治療后，其體內(nèi)的HGF，EGF，VEGF等的mRNA 表達(dá)與對(duì)照組相比有所增加，損傷肺內(nèi)出現(xiàn)了組織再生和修復(fù)[32-36]。這些生長因子被認(rèn)為有助于肺組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，而HGF的特異性與MSCs的抗凋亡作用有關(guān)[31]。以上作用機(jī)制對(duì)治療COPD具有指導(dǎo)意義。

四、 肺組織修復(fù)作用

肺氣腫的組織破壞的特征是肺泡附著的喪失，而MSCs治療可以恢復(fù)肺氣腫動(dòng)物模型中受損的肺泡結(jié)構(gòu)。因此，我們提出MSCs在上皮細(xì)胞中的植入和轉(zhuǎn)分化有助于肺氣腫中破壞的肺結(jié)構(gòu)的重建。有動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)MSCs 在給藥后 24 h之內(nèi)移入肺組織，但其數(shù)量似乎很少并隨時(shí)間的延長而逐漸減少[28]。盡管 MSCs的移入和保留可以增加肺損傷部位的MSCs，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并沒有直接證明移入的MSCs參與了肺組織的修復(fù)。目前尚缺乏MSCs 對(duì)毀損性肺部結(jié)構(gòu)重建的直接證據(jù)。但有研究表明MSCs 移植可以通過促進(jìn)香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD 小鼠內(nèi)源性肺干細(xì)胞的增殖來修復(fù)肺損傷[25]。

臨床應(yīng)用及展望

雖然我們對(duì)內(nèi)源性干細(xì)胞的作用機(jī)制有了一定的了解，但更詳細(xì)的作用機(jī)制尚不明確，且這些內(nèi)源性干細(xì)胞分化程度更高，是否有更好的干預(yù)方式可以激活其活性，促進(jìn)他們向受損的肺組織分化，仍需進(jìn)一步研究。另外，內(nèi)源性干細(xì)胞還不易被分離獲取，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究帶了巨大的挑戰(zhàn)，若應(yīng)用于臨床治療COPD尚存在局限性。與之相比，外源性干細(xì)胞作用機(jī)制相對(duì)明確，易于獲取，實(shí)驗(yàn)技術(shù)相對(duì)成熟，且已有臨床研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能夠安全有效的用于COPD 的治療，還明顯提高了患者的生存質(zhì)量，減少了病程中嚴(yán)重或致命的不良事件的發(fā)生[36-38]。雖然目前干細(xì)胞治療COPD的臨床研究還較少，仍有很多難題亟待解決，但干細(xì)胞獨(dú)特的生理特性及作用機(jī)制，為COPD的治療帶來新曙光，有望降低其高死亡率。