不同釀酒酵母對威代爾冰葡萄酒揮發性組分的影響

張小倩，馬玥，徐巖，李記明，唐柯*

1(教育部工業生物技術重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇 無錫，214122)4(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺，264000)

冰葡萄酒是利用氣溫在-8 ℃以下，葡萄樹上自然冰凍的葡萄，在低溫條件下壓榨、發酵而成的甜型葡萄酒[1]。獨特的釀造工藝，使得冰葡萄酒具有濃郁的蜂蜜、杏、焦糖等香氣特征[2]。酵母作為發酵過程中影響冰葡萄酒香氣的重要因素[3]，可以合成醇類、酯類等化合物，進而影響葡萄酒的香氣特征[4]。SYNOS等[5]使用4種酵母(V1116、EC1118、VL1、自然發酵)進行冰酒發酵，發現利用EC1118和自然發酵的冰葡萄酒中香氣化合物種類最多。CRANDLES等[6]發現，除苯乙酸乙酯、葡萄烷、4-乙烯基愈創木酚和1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘外，其他化合物在EC1118發酵的冰葡萄酒中含量高于自然發酵的冰葡萄酒。申靜云等[7]研究了非釀酒酵母和釀酒酵母混合發酵對威代爾冰葡萄酒香氣的影響，確定Hanseniasporaopuntiae更適合應用于冰葡萄酒發酵。

葡萄酒中香氣化合物種類多，濃度跨度大，鑒定過程困難繁瑣。目前，多用氣相色譜法(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)分析葡萄酒中的香氣化合物[8-10]。但是該方法存在共流出色譜峰現象，會干擾化合物的鑒定；且不能夠檢測出部分微量或痕量成分[11]。近年來，全二維氣相色譜與飛行時間質譜法，因其峰容量、靈敏度、選擇性和分辨率高而越來越多地被采用。采用GC×GC-TOFMS分析后，對獲得的大量數據進行主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚類分析(cluster analysis,CLA)、判別分析(discriminant analysis,DA)和Fisher比率[12]等化學計量學分析，可更好地挖掘樣品的特征[13]。如WELDEGERGIS等利用GC×GC-TOFMS對南非葡萄酒品種皮諾塔吉的化學成分進行的研究，得到了該品種香氣化合物詳細的表征[14]；而頂空固相微萃取技術與GC×GC-TOFMS系統結合，可以輕松地分離和鑒定葡萄酒香氣中的多種極性和非極性有機化合物，克服了樣品復雜性和共流出問題，能夠快速評價不同貯藏條件下葡萄酒的香氣特征[15]；因此GC×GC-TOFMS也成為分析復雜葡萄酒樣品香氣成分差異的首選分析工具，它可以更加全面地解析葡萄酒揮發性化合物的特征。

本研究采用HS-SPME結合GC×GC-TOFMS解析不同酵母發酵的威代爾冰葡萄酒的揮發性化合物，進一步比較不同酵母發酵冰葡萄酒揮發性組分的差異及特征。本項研究不僅可對后續深入研究酵母發酵冰葡萄酒的呈香機理提供理論基礎，同時對冰葡萄酒的發酵調控也具有良好的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

本研究樣品由張裕葡萄釀酒股份有限公司提供，采用2018年威代爾冰葡萄原料[壓榨后葡萄汁總糖380.5 g/L，總酸9.1 g/L(酒石酸計)]，分別由ST、K1、R2、EC1118四種用于冰葡萄酒發酵的商業酵母釀造而成的冰葡萄酒。

1.1.2 試劑與儀器

NaCl(化學純)，中國醫藥集團化學試劑有限公司； C7-C30直鏈正構烷烴、2-甲氧基-D3-苯酚、色譜級乙醇，美國 Sigma-Aldrich 公司。

MPS2多功能自動進樣系統，德國Gerstel 公司； DVB/CAR/PDMS三相萃取頭(2 cm 50/30 μm),美國Supelco Inc.；Pegasus?4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀(GC×GC-TOFMS)美國LECO Corp.；DB-FFAP型GC-MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm), 美國Agilent Technologies；Rxi-17Sil MS二維色譜柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Restek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取實驗方法

實驗方法參照本實驗室前期優化建立的方法并加以改進[16]。將5 mL冰葡萄酒樣品及1.5 g NaCl置于20 mL頂空瓶中，并添加10 μL 內標(2-甲氧基-D3-苯酚，終質量濃度為609.76 μg/L)，用帶PTFE/藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封后，由多功能自動進樣系統MPS2 進行HS-SPME操作。樣品在50 ℃下平衡5 min，萃取45 min，轉速設置為250 r/min。萃取完成后，吸附有揮發性化合物和半揮發化合物的萃取頭于GC 進樣口，在250 ℃下解吸附5 min，不分流，進行GC×GC-TOFMS 分析。相同條件下每個樣品各進樣3次。

1.2.2 GC×GC-TOFMS 分析方法及質譜條件

GC×GC-TOFMS分析方法及質譜條件參照本實驗室前期優化建立的方法[17]。GC-MS柱溫箱升溫程序：起始溫度45 ℃保持2 min，以4 ℃/min的速率升溫至230 ℃并保持15 min。調制器調制時間4 s，熱調制時間為1 s，調制補償溫度為20 ℃。二維柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃并保持5 min。以高純氦氣(>99.999 5%)作為載氣，恒流模式，流速：1 mL/min。

飛行時間質譜條件：采用EI離子源，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電壓控制70 eV。檢測器采集質量數范圍35～400 amu，采集頻率100 spectrum/s，檢測器電壓430 V。數據由LECO公司Pegasus 4D工作站采集。

1.2.3 數據處理

不同酵母發酵冰葡萄酒樣中揮發性化合物鑒定：利用儀器自帶ChormaTOF軟件對采集的數據進行解析，色譜峰的峰寬分別設為24 s和0.2 s，自動識別信噪比大于50的色譜峰后進行自動積分解卷積和質譜庫(NIST14，Wiley 9)比對。利用ChromaTOF軟件統計比較功能(statistical comparison)處理，峰對齊后，篩選策略參考劉志鵬等的方法[18]，選擇3個平行樣品中出現1次的峰作為這類酒樣中存在的組分。篩選相似度大于700的組分，并剔除沒有風味貢獻的烷烴類化合物和色譜柱流出物含硅類化合物等，作為初步鑒定結果。在此基礎上，相同條件下分析一系列正構烷烴(C7-C30)確定每個化合物的GC-MS色譜柱保留指數，并與文獻報道的保留指數比對確認，偏差在30以內的化合物作為最終定性的結果[19]。

運用MICROSOFT EXCEL 2013程序對不同酵母發酵的威代爾冰葡萄酒中揮發性化合物定量數據進行計算，運用SPSS STATISTICS 22進行主成分分析(PCA)、數據標準化，運用HEML 1.0繪制熱圖。

2 結果與討論

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS 技術解析冰葡萄酒中揮發性組分

通過GC×GC-TOFMS在不同酵母發酵的酒中共分離檢測到3 784個色譜峰，圖1-A展示了R2酵母發酵冰葡萄酒中揮發性組分的全二維分析的色譜圖，從圖1-B中可以看出，4-甲基-1-戊醇、1-丁醇、戊酸乙酯這3種化合物在一維共流出，很難定性定量分析，但在二維色譜得到了很好地分離。圖1-C展示了這3種化合物的質譜匹配。

圖1 R2酵母發酵冰葡萄酒中揮發性組分的全二維分析總離子流圖(A)及節選1個調制周期3個化合物色譜峰(B)和質譜圖(C)Fig.1 Analytical ion chromatogram contour plot analysis of volatile components in icewine fermented R2 yeast (A) andmodulated peaks of there compounds found in this icewine(B) and deconvoluted mass spectra of 3 compounds(C)

針對ChromaTOF軟件解圖后的數據，通過上述數據處理方法，最終在四種不同酵母冰葡萄酒樣中共定性出485種化合物(酯123種、萜烯26種、醇105種、羰基化合物115種、呋喃類23種、含氮化合物21種，揮發酚類19種，含硫化合物7種，芳香族化合物35種，內酯類11種)，秦紹智等[20]利用液-液萃取法結合GC-MS分析，在威代爾冰葡萄酒定性出59種揮發性物質，王蓓等[21]利用運用攪拌棒吸附萃取-氣相色譜/質譜聯用技術在威代爾冰葡萄酒定性出109種揮發性物質，檢出數量還是遠低于本研究，也表明GC×GC-TOFMS在揮發性化合物分離與鑒定上具有很大優勢，可以更加全面的認識冰葡萄酒香氣。

對不同酵母發酵威代爾冰葡萄酒樣中揮發性化合物進行統計，其中共有的化合物347種，占總揮發性化合物總數的72%。具體化合物統計結果如表1。從表1中我們可以看出不同酵母發酵的冰葡萄酒化合物差異主要集中在酯類、醇類及羰基化合物這3類酵母發酵產物上，這一結果也與其他冰葡萄酒研究一致[5-6]。

表1 不同酵母發酵冰葡萄酒GC×GC-TOFMS揮發性化合物種類Table 1 Table of volatile compounds in icewine fermentedby different yeasts

將定性出化合物的峰面積與內標物相比，得到半定量結果，利用標準化后的數據進行PCA分析，如圖2所示，2個主成分變量總計代表了總變量的72.33%，其中PC1解釋了總變量的45.29%，PC2解釋了27.03%。根據4種酵母發酵的威代爾冰葡萄酒的揮發性組分進行PCA分析得到了很好地區分，表明不同酵母發酵的酒樣揮發性化合物在種類和含量上存在其特征性。

圖2 不同酵母發酵冰葡萄酒主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of different yeastfermented icewines

在定性得到的揮發性化合物基礎上，結合香氣物質數據庫(http://www.flavornet.org/flavornet.html)篩選出156個具有香氣特征的揮發性化合物進一步分析，根據半定量數據繪制熱圖(圖3)。

由圖3所示，156種化合物根據其在不同酒樣中含量差異分為3個區域，其中A區域物質在R2酵母發酵的酒中含量高，B區域在ST酵母中含量最高，而C區域則在K1、EC1118酵母中含量最高。在A類化合物中，聚集了大部分的酯類、羰基化合物類、醇類和萜烯類化合物，其中1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮呈現為蘑菇味；1-己醇、β-大馬士酮、里那醇、香葉醇，表現為花香；辛酸乙酯、己酸乙酯，具有果香[22-23]； 1-庚醇為草藥味，這些化合物都是威代爾冰葡萄酒中報道過的關鍵香氣物質[16, 24]，B類主要是芳香族化合物和酯類化合物，其中乙酸苯乙酯(蜂蜜、玫瑰香氣)、醬油酮(甜香)、戊酸乙酯(果香)也都被報道為冰酒中的重要香氣化合物。C類化合物中聚集了全部的內酯類化合物，這些內酯類化合物普遍具有水果香和甜香。由以上分析可知，R2酵母發酵的冰葡萄酒中關鍵香氣如1-辛烯-3-醇、1-己醇、β-大馬士酮、里那醇、香葉醇、1-辛烯-3-酮等香氣物質含量明顯高于其他酵母，且其醇類、酯類、羰基化合物的含量上具有明顯優勢。

3 結論

本研究利用HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析了4種不同酵母發酵的威代爾冰葡萄酒樣的揮發性組分，通過質譜庫與保留指數比對相結合，并利用ChormaTOF軟件的統計比較功能，最終定性出485種揮發性組分，其中共有揮發性化合物347種。通過與香氣數據庫比對，共找到156種具有香氣特征的物質，進一步通過熱圖分析可以看出，R2酵母在酯類、醇類、萜烯類等化合物上具有顯著優勢，ST酵母在芳香族化合物上具有優勢，K1與EC1118酵母的內酯類化合物含量明顯高于其他酵母。

圖3 不同酵母發酵冰葡萄酒具有香氣特征的156種化合物熱圖Fig.3 Heat map of 156 compounds with different aroma characteristics of different yeast fermented icewines