松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應(yīng)與激活Nrf通路相關(guān)①

蘭戴天 何 力 李茂德 趙 源 趙曉晨

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院普外科,成都 610100)

膿毒癥是一種由宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引起，可導(dǎo)致全身炎癥和多器官功能障礙綜合征的致命性疾病。盡管使用了積極的外科治療、特定的抗生素和其他藥物制劑，膿毒癥與住院死亡率相關(guān)性仍高于10%[1]。膿毒癥發(fā)展和進(jìn)展的主要病理生理機(jī)制在于中炎癥介質(zhì)和抗炎因子之間動(dòng)態(tài)平衡的失調(diào)[2]。肝功能障礙和衰竭是膿毒癥的傳統(tǒng)并發(fā)癥，影響內(nèi)源性和外源性的生物轉(zhuǎn)化和運(yùn)輸，是膿毒癥的早期和頻發(fā)事件[3]。雖然肝功能障礙的發(fā)生率比其他重要器官的功能障礙的發(fā)生率低40% 左右，但肝功能障礙患者的死亡率比膿毒癥引起的呼吸系統(tǒng)功能障礙(最常見(jiàn)的器官功能障礙)患者的膿毒癥死亡率高54%[4]。此外，有研究表明在肝病患者中，膿毒癥的發(fā)病率比普通ICU患者高30%～50%[4]。考慮到肝臟在膿毒癥發(fā)病、發(fā)展和結(jié)局中的關(guān)鍵作用，肝損傷是膿毒癥患者臨床管理中開(kāi)發(fā)新的治療工具的重要目標(biāo)。松果菊苷(Echinaco-side,ECH)是一種從中國(guó)傳統(tǒng)中藥肉蓯蓉中分離得到的苯乙醇苷類(lèi)化合物(圖1)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、保護(hù)神經(jīng)、改善學(xué)習(xí)記憶及調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[5]，因此，預(yù)測(cè)松果菊苷可改善膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應(yīng)。本文主要研究松果菊苷對(duì)膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制。

圖1 松果菊苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of echinacoside

1 材料與方法

1.1材料 120 只體重為180～200 g的雌性Wistar大鼠，購(gòu)自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)：SYXK(川)2017-203。大鼠在25℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)室，自由獲取水和食物。在實(shí)驗(yàn)前1周開(kāi)始適應(yīng)性喂養(yǎng)。松果菊苷(HPLC≥98%，百靈威科技有限公司，貨號(hào)：82854-37-3)，地塞米松(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)：D1756)，蘇木素伊紅(Hematoxylin eosin，HE)染色試劑、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120、BC0200、BC1190、BC0170)，總蛋白定量測(cè)試盒、白蛋白含量測(cè)試盒、堿性磷酸酶試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(上海聯(lián)碩生物刻科技有限公司，貨號(hào)： ml016898、ml076981、ml016867、ml037336、ml016910、ml027458、ml037361、ml002813-1、ml00 2859)，HMGB1 ELISA試劑盒(上海基免實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)： JM-ELISA-0126)，TBARS試劑盒(上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司，貨號(hào)：0801192)。

1.2方法

1.2.1給藥及模型構(gòu)建 將大鼠分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、松果菊苷低劑量組(ECH-L)、松果菊苷中劑量組(ECH-M)、松果菊苷高劑量組(ECH-H)、陽(yáng)性對(duì)照組(DEX)，每組20只。在造模前1 h，通過(guò)尾靜脈分別注射生理鹽水、松果菊苷25、50、100 mg/kg[6]、地塞米松10 mg/kg[7]。通過(guò)盲腸結(jié)扎和穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)模式誘導(dǎo)膿毒癥[8]。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)腹膜內(nèi)注射15 mg/kg 氯胺酮和7.5 mg/kg甲苯噻嗪麻醉動(dòng)物。然后，在前腹部正中切開(kāi)3 cm，露出盲腸。將糞便拖至盲腸用5/0丙烯線(xiàn)結(jié)扎并固定在回盲部連接桿下方，但不能引起腸梗阻。用18號(hào)針頭將盲腸穿刺10次并稍微擠壓直至出現(xiàn)一小滴糞便。將盲腸重新放于腹腔，縫合傷口。假手術(shù)動(dòng)物接受了相同的剖腹手術(shù)，但沒(méi)有盲腸穿刺，并作為對(duì)照組。手術(shù)后不久，所有動(dòng)物皮下注射2 ml 0.9% 氯化鈉溶液。

1.2.2HE染色觀察肝損傷 肝臟固定在10%福爾馬林中，石蠟包埋，切成5 μm厚，二甲苯脫蠟，乙醇濃度降低時(shí)連續(xù)脫水。切片用蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察并使用ColorViewⅡ相機(jī)獲取20個(gè)隨機(jī)場(chǎng)(400倍放大)的圖像，并由兩名資深病理學(xué)家獨(dú)立評(píng)估肝臟損傷的組織形態(tài)學(xué)。

1.2.3血清指標(biāo)檢測(cè)肝功能 根據(jù)所提供的試劑盒手冊(cè)，評(píng)估血清總蛋白、白蛋白、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)，總膽紅素(total bilirubin，TBil)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transferase，γ-GT)的水平來(lái)分析肝功能。

1.2.4肝臟氧化應(yīng)激分析 根據(jù)所提供的試劑盒手冊(cè)，肝臟組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)和巰基水平，以及抗氧化酶過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)的活性來(lái)分析肝臟氧化應(yīng)激情況。

1.2.5炎癥因子檢測(cè) 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：將樣品加入各反應(yīng)孔，37℃ 反應(yīng) 45 min 。接著用洗滌液洗滌 4 次，再分別加入生物素標(biāo)記IL-1β、IL-6、TNF-α、HMGB1的抗體，在37℃孵育30 min。洗滌后加鏈霉親和素-HRP 混合均勻，在37℃ 反應(yīng) 30 min。接著加入顯色劑避光顯色。最后加終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)分選CD8+和CD4+分離肝臟組織，將肝臟組織剪碎研磨，用200目鋼網(wǎng)研磨過(guò)濾，用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解 5 min，然后用33.75% Percoll分離純化細(xì)胞，2 000 r/min離心20 min，再用0.5% BSA-PBS緩沖液重懸。用PMA和離子霉素刺激細(xì)胞4 h，并用針對(duì)PE-CD8和FITC-CD4的熒光綴合的抗體染色。 在FACS Calibur流式細(xì)胞儀中分析CD8+和CD4+細(xì)胞的頻率。

1.2.7蛋白印跡法檢測(cè) 在裂解緩沖液中提取總蛋白質(zhì)，并用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。將10 μg蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。 用5%脫脂奶粉封閉膜，然后用一抗(NQO1 1∶500、HO-1 1∶500、Nrf2 1∶1 000)在4℃ 封閉過(guò)夜，接著加入對(duì)應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，最后滴ECL曝光。以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity One軟件進(jìn)行分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝損傷 Sham組顯示正常大鼠的肝組織沒(méi)有炎癥、壞死的跡象；Model組大鼠的肝臟組織存在著明顯的水腫和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；ECH各組隨著給藥濃度的增加，肝臟組織的水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度逐漸減輕(圖2)。

圖2 HE染色觀察肝損傷程度Fig.2 Degree of liver injury was observed by HE staining

2.2松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝功能 各組大鼠的血清總蛋白含量、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性無(wú)明顯變化。與Sham組相比，Model組大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶活性、總膽紅素含量明顯增加(P<0.05，圖3)；與Model組相比，ECH-H組大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶活性、總膽紅素含量明顯減少(P<0.05，圖3)，其他各組無(wú)明顯變化；說(shuō)明高劑量的松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝功能。

圖3 通過(guò)試劑盒檢測(cè)肝功能指標(biāo)Fig.3 Liver function indicators detected by kitNote:A.Total protein content;B.γ-glutamyl transferase;C.Aspartate aminotransferase activity;D.Alanine aminotransferase activity;E.Alkaline phosphatase activity;F.Total bilirubin content;*.P<0.05 versus sham group;#.P<0.05 versus model group.

2.3松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝氧化應(yīng)激 與Sham組相比，Model組大鼠丙二醛含量明顯增加，過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶明顯減少(P<0.01，圖4)；與Model組相比，ECH-L組大鼠丙二醛含量、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性無(wú)明顯變化，ECH-M組大鼠丙二醛含量明顯減少，過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶明顯增加(P<0.05，圖4)，ECH-H組和DEX組大鼠丙二醛含量明顯減少，過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶明顯增加(P<0.01，圖4)；說(shuō)明高劑量的松果菊苷和地塞米松一樣能夠改善膿毒癥大鼠的肝氧化應(yīng)激。

圖4 通過(guò)試劑盒檢測(cè)肝氧化應(yīng)激水平Fig.4 Liver oxidative stress levels were detected by each kitNote:A.Malondialdehyde content;B.Superoxide dismutase;C.Catalase;D.Glutathione peroxidation;**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

2.4松果菊苷改善膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng) 與Sham組相比，Model組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量增加，而CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比均明顯減少(P<0.01，圖5、6)；與Model組相比，ECH-L組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量及CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比無(wú)明顯變化，ECH-M組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量減少而CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比明顯增加(P<0.05，圖5、6)，ECH-H組和DEX組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量減少、而CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比明顯增加(P<0.01，圖5、6)；說(shuō)明高劑量的松果菊苷和地塞米松一樣能夠改善膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)。

圖5 通過(guò)ELISA檢測(cè)相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of inflammation-related factors were detected by ELISANote:A.TNF-α content was detected by ELISA;B.IL-6 content was detected by ELISA;C.IL-1β content was detected by ELISA;D.HMGB1 content was detected by ELISA;**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

圖6 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟CD8+和CD4+T細(xì)胞的比例Fig.6 Proportion of liver CD8+and CD4+T cells by flow cytometryNote:A.CD8+and CD4+were sorted by flow cytometry;B.Percentage of CD4+;C.Percentage of CD8+;D.CD4+/CD8+ratio;**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

2.5松果菊苷激活膿毒癥大鼠Nrf2信號(hào)通路 轉(zhuǎn)錄因子核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid-2-related factor 2，Nrf2)信號(hào)通路是治療膿毒癥所致肝損傷過(guò)程中關(guān)鍵信息通路，通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白還原型輔酶/醌氧化還原酶[NAD(P) H:quinone oxidoreductase-1，NQO1]、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、Nrf2表達(dá)發(fā)現(xiàn)：與Sham組相比，Model組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01，圖7)；與Model組相比，ECH-L組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，ECH-M組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05，圖7)，ECH-H組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01，圖7)；說(shuō)明高劑量的松果菊苷激活膿毒癥大鼠Nrf2信號(hào)通路。

圖7 通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平Fig.7 NQO1,HO-1,Nrf2 protein expression levels were detected by Western blotNote:**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

3 討論

膿毒癥是由如內(nèi)毒素、外毒素、病毒或成熟因子等多種因素引起的全身性炎癥反應(yīng)，可激活強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，甚至免疫失調(diào)，從而引起器官功能障礙和器質(zhì)損害。盡管在治療方法和重癥監(jiān)護(hù)方面有所改善，但膿毒癥的發(fā)生率和死亡率仍在繼續(xù)增加[9]。膿毒癥患者通常發(fā)生多器官功能衰竭，肺、肝、腎和心臟是嚴(yán)重受影響的器官，有研究表明，每增加一個(gè)器官的衰竭，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加15%～20%[10]。肝功能障礙是一種與膿毒癥密切相關(guān)的臨床并發(fā)癥，并已作為嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克的重癥患者高死亡率的有力預(yù)測(cè)因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷能夠明顯降低膿毒癥大鼠的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶活性、總膽紅素含量。其中，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)；堿性磷酸酶是一種經(jīng)肝臟向膽外排出的酶，是診斷膽道系統(tǒng)疾病時(shí)常用的指標(biāo)；總膽紅素是膽汁的重要成分之一，臨床上主要用于診斷肝臟疾病和膽道梗阻。且已有研究表明松果菊苷對(duì)小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[12]，這與本文研究結(jié)果相一致。

有證據(jù)證實(shí)氧化應(yīng)激是膿毒癥的一個(gè)病理過(guò)程，它會(huì)損害細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致多個(gè)器官功能障礙。因此，人們提出了幾種抗氧化處理方法，并取得了成功。如，褪黑素通過(guò)抗氧化治療膿毒癥后肝功能損害[13]。本文研究表明松果菊苷能減少膿毒癥大鼠肝組織中丙二醛含量，增加過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，從而改善膿毒癥大鼠的肝氧化應(yīng)激，進(jìn)而減輕膿毒癥后肝功能損害。

膿毒癥肝損傷的主要原因是炎癥介質(zhì)的過(guò)度生成。在膿毒癥中，肝細(xì)胞尤其是庫(kù)普弗細(xì)胞被微生物因子激活，激活庫(kù)普弗細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)如IL-1β、IL-6和TNF-α等[14]。這些介質(zhì)或被釋放到體循環(huán)中介導(dǎo)多器官損傷，或通過(guò)旁分泌介導(dǎo)肝損傷與肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞相互作用。已有研究表明，抑制肝臟炎癥可減輕肝損傷，降低膿毒癥的發(fā)病率和死亡率[15]。在膿毒癥炎癥的初始階段，TNF-α是第一個(gè)釋放的促炎因子。IL-1β和IL-6的持續(xù)增加表明膿毒癥的預(yù)后不良。晚期的炎癥反應(yīng)可以通過(guò)單核巨噬細(xì)胞激活HMGB1的大量分泌。本文研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷能減少膿毒癥大鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量。促炎和抗炎不平衡導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，T淋巴細(xì)胞亞群在一定程度上可針對(duì)細(xì)胞免疫狀態(tài)誘導(dǎo)相應(yīng)的反應(yīng)。膿毒癥會(huì)引起CD4+和CD8+含量的下降，據(jù)報(bào)道，CD4+/CD8+下降表明膿毒癥加重且預(yù)后較差[16]。CD4+T 細(xì)胞為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞，其在細(xì)胞免疫反應(yīng)方面作用的發(fā)揮主要是通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子的激活和(或) 募集靶細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。CD4+T細(xì)胞在多種病原微生物膿毒癥中具有啟動(dòng)免疫反應(yīng)的作用，促進(jìn)早期病原菌細(xì)胞的清除，從而減輕膿毒癥引起的器官損傷[17]。CD8+T 細(xì)胞在抗胞內(nèi)感染的免疫機(jī)制中，細(xì)胞殺傷效應(yīng)占重要地位，能識(shí)別和溶解靶細(xì)胞，殺傷病原體，對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體產(chǎn)生有效和持久的免疫應(yīng)答。CD4+、CD8+的變化基本可以反映膿毒癥患者的細(xì)胞免疫狀況。本文研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷能增加膿毒癥大鼠CD4+和CD8+含量，并增加CD4+/CD8+，說(shuō)明松果菊苷能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來(lái)減輕膿毒癥。

治療膿毒癥肝損傷的有效途徑之一就是Nrf2信號(hào)通路，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路改善膿毒癥模型大鼠肝臟損傷[3]。Nrf2由NFE2L2基因編碼，是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子。在靜止條件下，Nrf2通過(guò)其阻遏型kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)保持在細(xì)胞質(zhì)中，并通過(guò)酶降解將其除去。當(dāng)細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激、炎癥等有害攻擊時(shí)，Nrf2從Keap1解離并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞核，在那里它與其下游基因啟動(dòng)子內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidant response element，ARE)結(jié)合，包括尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，還原型輔酶/醌氧化還原酶[NAD(P) H:quinone oxidoreductase-1，NQO1]，血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，谷氨酸半胱氨酸連接酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等[18]。這些基因中的大多數(shù)是重要的抗氧化酶和細(xì)胞保護(hù)基因。Nrf2通過(guò)與ARE結(jié)合可以上調(diào)NQO1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)抗氧化和炎癥細(xì)胞因子。HO-1被認(rèn)為是血紅素降解的初始和限速酶的誘導(dǎo)型同種型，有助于免疫調(diào)節(jié)和抗炎功能，可以通過(guò)Nrf2核轉(zhuǎn)位來(lái)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[19]。已有研究表明，松果菊苷通過(guò)Nrf2/HO-1依賴(lài)途徑保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應(yīng)與激活Nrf通路相關(guān)。

綜上所述，松果菊苷能夠減輕肝損傷，改善肝功能、肝氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并激活Nrf通路，分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本文為松果菊苷的開(kāi)發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)，為膿毒癥的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。