蛋氨酸限制對高脂飲食誘導的肥胖小鼠胰島功能損傷的改善作用

羅婷玉，楊玉輝，許云聰，高秋麗，施用暉，吳國卿，樂國偉,*

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

近年來，肥胖的發病率逐年增加，引起了社會的廣泛關注。長期肥胖會導致胰島素抵抗（insulin resistance，IR），具有進一步引發2型糖尿病的風險[1-2]。IR增加了機體對胰島素合成和分泌的需求，在胰腺內質網所合成的蛋白中超過50%為前胰島素，因此當機體發生IR時，胰腺通過增加胰島素的合成以維持正常的血糖水平，從而導致β細胞內質網負荷過大，產生過量的錯誤折疊蛋白，因而產生內質網應激，導致β細胞功能障礙并促進細胞凋亡[3-4]。大量動物及人體研究表明，IR個體內參與內質網應激的相關信號分子，如C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、肌醇需求激酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）和重鏈結合蛋白（heavychain binding protein，Bip）在β細胞中均高度表達[5-6]。此外，研究發現胰島β細胞的抗氧化酶水平較低[7]，在肥胖狀態下極易產生過量脂質過氧化產物，其可進一步加劇β細胞內質網應激，影響胰島素的合成與分泌，損傷胰島細胞，甚至造成胰腺功能性障礙[8-9]。

自Orentreich等發現將飲食中的蛋氨酸含量從0.86%限制到0.17%可以增加30%～40%的壽命以來[10]，對飲食蛋氨酸限制（methionine restriction，MR）的研究日益增多且逐步深入，研究發現MR在降低體質量、抗炎、減輕氧化應激以及在增加胰島素敏感性等方面均有顯著的效果[11-13]。與能量限制和其他方法相比，MR的優勢在于它只通過限制飲食中的蛋氨酸攝入量而非減少正常的飲食攝入來改善胰島素敏感性。Lees等[14]發現MR可以逆轉與年齡相關的IR，并證明胰島素敏感性的改善并不是減輕體質量后的間接結果，MR可通過某些因素直接影響胰島素敏感性。胰腺作為胰島素分泌的重要組織，在調控機體糖代謝、改善IR方面發揮著巨大作用。然而目前還鮮有研究報道MR對于高脂飲食誘導的肥胖小鼠胰腺組織損傷的影響。因此，本實驗以C57BL/6J小鼠為研究對象，利用高脂飲食誘導肥胖模型，探究MR對高脂飲食誘導的小鼠胰腺保護作用，為肥胖、IR以及糖尿病人群的飲食策略提供新的思路和參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6J雄性小鼠（4 周齡，約18 g），購于南京生物醫藥研究院，生產許可證號：SCXK（蘇）2015-0001，合格證號201605176。

血糖試紙 強生（上海）醫療器械有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）、蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色液 南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑 美國Biomiga公司；RNA提取試劑盒、SYBR Green Master Mix諾維贊生物科技公司；基因引物 上海捷瑞生物工程公司；小鼠胰島素酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 慧嘉生物科技公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

倍優血糖儀 強生（上海）醫療器材有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Epoch酶標儀 美國Bio-Tek公司；ETC811聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 東勝興業科學儀器有限公司；7900HT Fast實時熒光PCR儀美國ABI公司；石蠟組織切片機 德國Leica公司；BX43F顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼喂及分組

表 1 飼料組成Table 1 Compositions of experimental diets g/100 g

本研究動物實驗經江南大學動物倫理審查委員會批準，許可證號JN.No.20161207-20170728，按照國家實驗動物福利指導方針進行。將210 只C57BL/6J雄性小鼠以正常飼料適應性喂養一周后，按照體質量隨機分成兩組：正常飲食組（CON組，n＝30，0.86%（質量分數，下同）蛋氨酸+4%脂肪）和高脂飲食組（HF組，n＝180，0.86%蛋氨酸+20%脂肪）。10 周后，HF組有120 只小鼠成功建立肥胖模型（肥胖度大于20%）。將成功建立肥胖模型的小鼠按照體質量隨機分成4 組：1）高脂飲食組（HF組，n＝30）；2）高脂+MR飲食組（HF+MR組，n＝30，0.17%蛋氨酸+20%脂肪）；3）恢復正常飲食組（C*組，n＝30，0.86%蛋氨酸+4%脂肪）；4）恢復正常+MR飲食組（C*+MR組，n＝30，0.17%蛋氨酸+4%脂肪）。實驗小鼠飼養于SPF級動物房，12 h/12 h晝夜循環光照，環境溫度（22f2）℃、相對濕度（50f10）%，保持飼養環境衛生。所有實驗小鼠均自由飲水采食，每周稱體質量并記錄，采食量分別在造模成功分組后第8、16、24周采用綜合實驗動物監測系統測定。飼料配方如表1所示。

1.3.2 口服糖耐量測定

造模成功后，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，尾部采血測0 min血糖濃度；質量分數50%葡萄糖溶液以2 g/kgmb灌胃后，分別在15、30、60、90、120 min測血糖濃度，并計算血糖曲線下面積（area under curve，AUC）。

1.3.3 血液、胰腺樣品的采集

飼養結束后，小鼠宰殺前禁食不禁水12 h，稱體質量，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，放入肝素鈉抗凝管中，其余血液放置30 min后4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-80 ℃保存備用。斷頸處死，冰上迅速取胰腺，其中取0.1 g左右胰腺組織置于TRIzol試劑中，剪碎，-80 ℃保存用于總RNA的提?。蝗〖s0.1 g胰腺組織浸入體積分數4%中性甲醛溶液中固定，4 ℃保存用于石蠟切片觀察組織形態。

1.3.4 血漿及胰腺指標測定

空腹胰島素以及血漿和胰腺T-AOC、MDA、GSH、GSSG、GSH-Px水平均按照試劑盒說明書測定。胰島素抵抗指數（insulin resistance index，HOMA-IR）按下式計算。

1.3.5 血漿和胰腺H2S水平測定

取100 μL樣品，加入0.25 mL質量分數15%醋酸鋅溶液和0.45 mL雙蒸水，室溫放置10 min；加入質量分數10%三氯乙酸溶液0.25 mL，4 ℃、14 000hg離心10 min；取上清液600 μL，加入對苯二胺鹽酸鹽溶液（20 mmol/L）133 μL以及FeCl3（30 mmol/L）133 μL，充分混勻；室溫靜置20 min，于670 nm波長處測吸光度。用Na2S標準溶液制作標準曲線。

1.3.6 胰腺HE染色

胰腺在甲醛中固定后進行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，在包埋機中將樣品浸入石蠟包埋；預冷后將蠟塊固定在切片機上切成5 μm薄片，溫水展開后平貼于載玻片上；HE染色嚴格遵循試劑盒說明書進行，滴少許中性樹脂封片，自然通風晾干；置于顯微鏡下200 倍放大觀察胰腺切片并采集圖片。

1.3.7 胰腺總RNA提取及反轉錄

用TRIzol法提取胰腺中的總RNA，通過測定溶液中吸光度比值（A260nm/A280nm）確定所得RNA的純度，測得吸光度比值在1.8～2.0之間可用于下一步實驗。加入適量DEPC水稀釋至1 μg/mL，取2.0 μg模板RNA進行擴增，擴增條件為：37 ℃，1.5 h；95 ℃，5 min；4 ℃冷卻。反轉錄所得cDNA存于-80 ℃備用。

1.3.8 實時熒光定量PCR分析

參照試劑盒說明書，以β-actin為內標，測定B細胞淋巴瘤基因2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2同源促凋亡基因（Bcl-2 associated protein X，Bax）、轉錄因子X盒結合蛋白-1（X-box binding protein-1，Xbp-1）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）、胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）、葡萄糖轉運載體2（glucose transporter 2，GLUT2）、肌腱膜纖維肉瘤腫瘤基因同系物A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A，MafA）、十二指腸同源框因子-1（pancreatic duodenal homeobox-1，Pdx-1）、CHOP、IRE1-α和BipmRNA的表達量，引物序列如表2所示。使用實時熒光定量PCR儀檢測各模板的Ct值，通過2-ΔΔCt法進行相對定量。反應體系如下：0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、5.4 μL SYBR Green Master Mix、3.7 μL無菌水和0.5 μL cDNA模板，形成10 μL體系。擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環40 次；72 ℃終末延伸2 min；4 ℃冷卻。

表 2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，各組間的比較采用單因素方差分析，對滿足方差齊性的結果用Tukey檢驗進行多重比較，方差不齊時采用Tamhane檢驗。結果以平均值±標準差表示。當P＜0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 MR對肥胖小鼠體質量、采食量和能量攝入的影響

由圖1可知，與CON組小鼠相比，HF組小鼠體質量顯著增加（P＜0.05）；HF+MR組小鼠體質量顯著低于HF組小鼠（P＜0.05）；C*組小鼠體質量停止增長，并在16 周后出現下降趨勢；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠體質量顯著降低（P＜0.05）。

圖 1 MR對肥胖小鼠體質量的影響Fig. 1 Effect of dietary MR on body mass of obese mice

表 3 MR對肥胖小鼠采食量和能量攝入的影響Table 3 Effect of dietary MR on food intake and energy intake

由表3可知，在8、16 周和24 周，與CON組小鼠相比，HF組小鼠采食量顯著下降，能量攝入顯著增加（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠以及C*組小鼠采食量和能量攝入均顯著增加（P＜0.05）；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠采食量和能量攝入量均顯著增加。

2.2 MR對肥胖小鼠血糖、胰島素水平、HOMA-IR和口服糖耐量的影響

由表4可知，8～24 周，與CON組小鼠相比，HF組小鼠空腹血糖水平顯著增加（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠以及C*組小鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠空腹血糖水平顯著下降（P＜0.05）；盡管HF+MR組小鼠血糖水平高于C*+MR組，但在8 周后無顯著性差異。同CON組小鼠相比，HF組小鼠空腹胰島素水平在8、16 周和24 周顯著上升（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠空腹胰島素水平在8、16 周和24 周均顯著下降（P＜0.05）；C*組小鼠與C*+MR組小鼠空腹胰島素水平無顯著性差異；此外，24 周時，HF+MR組小鼠與C*+MR組小鼠空腹胰島素水平無顯著性差異。HOMA-IR及口服糖耐量實驗結果（圖2）顯示，HF組小鼠顯著高于CON組；HF+MR組小鼠顯著低于HF組（P＜0.05），且與C*+MR組小鼠無顯著性差異。

表 4 MR對肥胖小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平和HOMA-IR的影響Table 4 Effect of dietary MR on fasting blood glucose and plasma insulin levels and insulin resistance index

圖 2 MR對肥胖小鼠24 周時糖耐量（A）和AUC（B）的影響Fig. 2 Effect of dietary MR on glucose tolerance test (A) and area under curve (B) at 24 weeks

2.3 MR對肥胖小鼠胰腺組織形態的影響

圖 3 胰腺HE染色結果（200×）Fig. 3 Pancreatic hematoxylin eosin staining (200 ×)

如圖3所示，CON組小鼠胰島呈圓形，胞漿界限清晰，胰島β細胞大小一致，核染色質清晰；與CON組相比，HF組胰島β細胞形態不一，胞漿界限不清晰；與HF組小鼠相比，HF+MR組、C*組以及C*+MR組小鼠胰島胞漿略有不均勻，但胞漿界限清晰。

2.4 MR對肥胖小鼠血漿氧化還原狀態的影響

表 5 飲食MR對肥胖小鼠血漿氧化還原狀態的影響Table 5 Effect of MR on plasma redox status in obese mice

由表5可知，在16 周和24 周，HF組小鼠較CON組血漿GSH-Px水平顯著下降（P＜0.05），HF+MR組小鼠血漿GSH-Px水平較HF組小鼠顯著增加（P＜0.05）；C*、HF+MR組與C*+MR組小鼠GSH-Px水平無顯著性差異。HF+MR組小鼠血漿GSH/GSSG較HF組小鼠在8、16 周和24 周時顯著增加（P＜0.05）；C*+MR組小鼠較C*組小鼠GSH/GSSG在8 周顯著增加（P＜0.05），16 周和24 周無顯著性差異。3 個周期的實驗結果顯示，HF組小鼠較CON組小鼠血漿T-AOC顯著降低（P＜0.05），HF+MR組小鼠較HF組小鼠血漿T-AOC顯著增加（P＜0.05）；16 周及24 周時，C*+MR組小鼠較C*組小鼠血漿T-AOC顯著增加（P＜0.05），C*+MR組與HF+MR組小鼠相比無顯著性差異。3 個周期中，與CON組相比，HF組小鼠MDA水平顯著增加（P＜0.05）；HF+MR組小鼠較HF組小鼠MDA水平顯著下降（P＜0.05）；C*+MR組小鼠較C*組小鼠MDA水平顯著下降（P＜0.05）；C*+MR組與HF+MR組小鼠無顯著性差異。

2.5 MR對肥胖小鼠胰腺氧化還原狀態的影響

由表6可知，CON組、HF組、HF+MR組小鼠胰腺GSH水平3 個周期均無顯著性差異；16 周及24 周時，C*+MR組小鼠GSH水平比C*組小鼠顯著下降（P＜0.05）。與CON組小鼠相比，HF組小鼠胰腺GSH/GSSG從16 周開始顯著下降（P＜0.05）；HF+MR組小鼠胰腺GSH/GSSG較HF組小鼠在24 周顯著增加（P＜0.05），且與C*+MR組小鼠無顯著性差異。16 周及24 周時，HF組小鼠較CON組小鼠胰腺T-AOC顯著降低（P＜0.05），HF+MR組小鼠較HF組小鼠胰腺T-AOC顯著增加（P＜0.05）；8 周時，C*+MR組小鼠較C*組小鼠胰腺T-AOC顯著增加（P＜0.05），16 周及24 周時無顯著性差異。3 個周期中，與CON組相比，HF組小鼠MDA水平呈增加趨勢，8 周和16 周顯著增加（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠3 個周期的MDA水平均顯著下降（P＜0.05）；C*+MR組小鼠與C*組小鼠MDA水平無顯著性差異；HF+MR組與C*+MR組小鼠相比呈下降趨勢，3 個周期均有顯著性差異（P＜0.05）。

表 6 飲食MR對肥胖小鼠胰腺氧化還原狀態的影響Table 6 Effect of MR on pancreas redox status in obese mice

2.6 MR對肥胖小鼠血漿和胰腺H2S水平以及胰腺H2S合成相關基因表達的影響

如圖4所示，16 周及24 周，HF組小鼠血漿以及胰腺H2S水平較CON組小鼠顯著下降（P＜0.05），HF+MR組小鼠血漿以及胰腺H2S水平較HF組小鼠顯著增加（P＜0.05）；C*組、HF+MR組與C*+MR組小鼠血漿H2S水平無顯著差異；8 周時，C*+MR組比C*組小鼠胰腺H2S水平顯著上升（P＜0.05），16 周及24 周無顯著性差異。16 周及24 周，HF組小鼠胰腺CBSmRNA表達量較CON組小鼠顯著下降（P＜0.05）；8 周和16 周HF+MR組小鼠胰腺CBSmRNA表達量較HF組顯著增加（P＜0.05）；8 周及24 周，C*+MR組較C*組小鼠CBSmRNA表達量顯著增加（P＜0.05）。與CON組相比，HF組CSEmRNA表達量顯著下降（P＜0.05）；8 周和16 周HF+MR組小鼠CSEmRNA表達量較HF組小鼠顯著增加（P＜0.05）；24 周時，C*+MR組小鼠胰腺CSEmRNA表達量較C*組顯著增加（P＜0.05）。

圖 4 MR對肥胖小鼠血漿（A）、胰腺H2S含量（B）、胰腺CBS（C）和胰腺CSE（D）mRNA相對表達量的影響Fig. 4 Effect of dietary MR on H2S levels in plasma (A) and pancreas (B), CBS (C) and CSE (D) mRNA expression level in pancreas of obese mice

2.7 MR對肥胖小鼠胰腺內質網應激相關基因表達的影響

如圖5所示，HF組小鼠較CON組小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1mRNA表達量呈上升趨勢，其中CHOP基因表達量在3 個周期均顯著增加（P＜0.05），IRE1-α和Xbp-1表達量均在16 周及24 周顯著增加（P＜0.05）；HF+MR組小鼠較HF組小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1表達量呈下降趨勢，其中CHOP基因表達量在3 個周期均顯著降低（P＜0.05），IRE1-α和Xbp-1表達量均在16 周及24 周顯著降低（P＜0.05）；與C*組、HF+MR組小鼠相比，C*+MR組小鼠CHOP、IRE1-α和Xbp-1mRNA表達量無顯著性差異；BipmRNA表達量在不同組小鼠中均無顯著性差異。

圖 5 MR對肥胖小鼠胰腺CHOP（A）、IRE1-α（B）、Bip（C）和Xbp-1（D）mRNA相對表達量的影響Fig. 5 Effect of dietary MR on CHOP (A), IRE1-α (B), Bip (C) and Xbp-1 (D) mRNA expression level in pancreas of obese mice

2.8 MR對肥胖小鼠胰腺組織細胞凋亡相關基因表達的影響

如圖6所示，與CON組小鼠相比，HF組小鼠BaxmRNA表達量上升，其中24 周差異顯著；Bcl-2mRNA表達量下降，其中16 周及24 周差異顯著（P＜0.05）；與HF組小鼠相比，HF+MR組小鼠BaxmRNA表達量3 個周期均顯著下降（P＜0.05），Bcl-2mRNA表達量在16 周和24 周顯著上升（P＜0.05）；與C*組小鼠相比，C*+MR組小鼠BaxmRNA表達量下降，Bcl-2mRNA表達量上升，均在第8周有顯著差異（P＜0.05）；C*+MR組小鼠同HF+MR組小鼠BaxmRNA表達量無顯著性差異；24 周時C*+MR組小鼠同HF+MR組小鼠Bcl-2mRNA表達量無顯著性差異。

圖 6 MR對肥胖小鼠胰腺Bax（A）和Bcl-2（B）mRNA相對表達量的影響Fig. 6 Effect of dietary MR on Bax (A) and Bcl-2 (B) mRNA expression level in pancreas of obese mice

2.9 MR對肥胖小鼠胰腺胰島素分泌相關基因表達的影響

圖 7 MR對肥胖小鼠胰腺MafA（A）、Pdx-1（B）和GLUT2（C）mRNA相對表達量的影響Fig. 7 Effect of dietary MR on MafA (A), Pdx-1 (B) and GLUT2 (C)mRNA expression level in pancreas of obese mice

如圖7所示，3 個不同實驗周期中，HF組小鼠較CON組小鼠MafA和Pdx-1mRNA表達量顯著降低（P＜0.05）；HF+MR組小鼠較HF組小鼠MafA和Pdx-1mRNA表達量顯著增加（P＜0.05）；C*+MR組小鼠與C*組小鼠相比MafA和Pdx-1mRNA表達量均上升，其中8 周和24 周時差異顯著（P＜0.05）；8 周和24 周時C*+MR組小鼠同HF+MR組小鼠相比無顯著性差異。GLUT2mRNA在不同周期及不同組小鼠胰腺中的表達量均無顯著差異。

3 討 論

本研究結果發現，MR在增加肥胖小鼠采食量和能量攝入的條件下，能夠降低肥胖小鼠的體質量，說明MR具有非常有效的減肥降脂作用，這與本課題組之前的研究結果一致[15-16]。另外，MR也能夠改善IR，使得肥胖小鼠的血糖維持在正常水平。過去的研究也報道MR能夠改善IR，增加胰島素敏感性[17-18]。胰島β細胞在分泌胰島素、維持機體血糖穩態中發揮了重要的作用，肥胖引起的氧化應激可損傷胰島β細胞結構[19]。本研究的胰腺組織HE染色切片結果顯示，HF+MR和C*+MR組小鼠均有較為均勻的胰島胞漿，胞漿界限較為清楚，說明MR能夠有效改善高脂誘導的小鼠胰腺組織損傷。許多研究表明，胰島β細胞對內質網應激十分敏感[20]。內質網應激時，CHOP表達增加，Bip與IRE1-α等蛋白相解離，激活的IRE1-α特異性剪切Xbp-1，促進Xbp-1s轉錄[4,9]。長期高脂飲食可以破壞機體氧化還原體系，進一步造成內質網應激，損傷胰腺。本研究結果發現MR可顯著降低肥胖小鼠胰腺CHOP、IRE1-α和Xbp-1基因的表達水平，說明MR能夠改善肥胖誘導的小鼠胰腺內質網應激，進而改善胰島β細胞功能。

機體的氧化還原體系同胰腺功能密切相關，但胰島β細胞的抗氧化酶水平較低[21-22]，極易產生脂質過氧化產物。功能正常的抗氧化防御系統可有效調節機體的氧還原狀態，其中T-AOC是反映機體抗氧化功能的綜合性指標；GSH-Px是過氧化物分解酶，可分解體內的脂質過氧化物；GSH可與活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）結合被氧化成GSSG，因此，GSH/GSSG可有效反映機體氧化還原狀態；MDA是脂質過氧化的最終產物，其可以間接反映細胞遭受ROS損傷的程度。本研究結果顯示，MR可有效降低胰腺和血漿中MDA水平，增加T-AOC、GSH-Px水平和GSH/GSSG，表明MR可能通過增加胰腺的抗氧化酶活性，從而增加胰腺抗氧化能力，減少ROS的產生，改善由肥胖造成的氧化應激，進而實現對胰島β細胞的保護作用。

有研究發現MR可增加機體H2S水平[23-24]，H2S作為重要的氣體信號分子，在保護胰島β細胞中發揮著重要作用[25-26]，其在機體中主要通過CSE和CBS作用產生。有研究指出，在高脂飲食條件下，CSE基因敲除小鼠同正常小鼠相比，胰島細胞更易受到糖脂毒性的危害[27]。體外實驗表明，將胰島細胞長期暴露在H2S供體NaHS中可顯著減少細胞凋亡，其與H2S改善了胰島細胞氧化應激相關[28]。本研究發現MR顯著增加了血漿和胰腺中H2S水平，不同程度上調了CBS及CSEmRNA表達水平，提示MR可能通過增加H2S的水平改善機體氧化還原狀態，從而保護胰腺組織。此外，有研究表明，氧化應激和內質網應激相互作用，互為因果。機體抗氧化水平降低，脂質過氧化物過度累積可導致內質網氧化還原狀態失衡，蛋白錯誤折疊增加；而蛋白質錯誤折疊增加可導致ROS的產生，進一步導致機體的氧化應激[8,29]。因此，MR可能通過同時改善肥胖小鼠胰腺內質網應激和氧化還原狀態，維持胰島β細胞正常功能。

此外，內質網應激與胰島β細胞凋亡和胰島素分泌相關。CHOP表達增加會導致促凋亡基因表達增加，抗凋亡基因表達減少，因此細胞凋亡通路被激活，胰島β細胞凋亡增加[30]。本研究發現，MR顯著降低了BaxmRNA表達水平，增加了Bcl-2mRNA表達水平，說明MR減少了胰島細胞凋亡。Pdx-1以及MafA對胰島細胞發育和胰島素分泌至關重要，Johnson等的研究表明Pdx-1+/-小鼠糖耐量下降、胰島素分泌減少、胰島細胞凋亡增加[31]；Allagnat等的研究表明長期內質網應激持續產生的XBP-1抑制了Pdx-1以及MafA的表達[32]。本研究結果顯示，MR顯著上調了胰腺中Pdx-1以及MafAmRNA表達水平，表明MR改善了肥胖小鼠胰腺的功能，促進了其胰島素的分泌。GLUT2也在內質網上合成，其作為胰腺中葡萄糖的主要轉運載體，在葡萄糖刺激促進胰島素分泌過程中十分重要[33]。本研究結果顯示，HF組GLUT2mRNA表達水平下降，HF+MR組GLUT2mRNA表達水平增加，但均無顯著差異。提示MR促進胰島素的分泌并非通過促進GLUT2表達實現。

本研究發現在小鼠肥胖后，MR的減重效果在恢復正常飲食模式下效果更為顯著，其可能與飲食結構和能量來源不同相關，而無論在高脂飲食還是恢復到正常脂肪飲食的條件下，中長期飲食MR無需限制能量攝入，均能夠改善肥胖小鼠IR。而且MR限制能夠使得肥胖小鼠在兩種飲食模式下，胰腺氧化還原狀態、H2S水平、內質網應激、細胞凋亡和胰島素分泌相關基因表達水平基本一致，暗示了MR飲食在改善肥胖誘導的胰腺損傷時可以不需要控制能量的攝入。

綜上，飲食MR能夠改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠胰腺組織內質網應激和氧化還原狀態失衡，減少胰腺組織細胞凋亡，進而緩解胰腺組織損傷，促進胰腺胰島素分泌，從而起到改善肥胖小鼠IR和血糖水平的作用。本研究從飲食的角度為改善長期肥胖誘導的IR以及胰腺損傷提供了新的思路。