基于陰陽理論與生物信息學方法探討抗腦缺血再灌注損傷后炎癥反應的思路與方法

楊小鈺，楊仁義，黃海紅，諶澤芳，傅馨瑩，張偉

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

中風已經成為世界范圍致死與致殘的重要原因之一[1],其中炎癥反應對于腦血管損傷尤為嚴重。腦缺血再灌注屬于腦缺血性中風，極大威脅人類的生活質量以及生命安全?，F階段缺乏對腦缺血再灌注炎癥反應系統詳細的病理生理機制探索，因此無法有效全面治療此類疾病?；蜓芯筷J入人們的視野，有望提供進一步的解決思路。“陰陽”貫穿中醫理論，合理運用中醫理論解釋缺血性中風病因病機，發揮中醫藥特色，為中西醫結合抗腦缺血再灌注炎癥反應提供治療依據。

1 腦缺血再灌注炎癥反應的病理生理研究

過度的炎癥反應，是腦缺血再灌注損傷進一步加重的主要原因[2]。小膠質細胞、星形膠質細胞和白細胞作為中樞神經系統炎癥反應的細胞基礎[3]，在炎癥級聯反應中發揮重要作用。腦缺血再灌注后，小膠質細胞活化是炎癥反應開始的標志；星形膠質細胞受損，與小膠質細胞表達各種炎癥相關因子如：白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核轉錄因子、血小板活化因子等，靶細胞表面的細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附因子-1(VCAM-1)等大量釋放，血管內白細胞通過遷移、黏附、活化，附著在血管內壁，釋放炎癥介質，進一步加劇了白細胞的聚集，造成周而復始的循環；血管發生堵塞，形成血栓并從而減少血流。白細胞也可透過血管壁，加重腦組織損傷。

其中炎癥細胞活化釋放大量的炎癥因子是炎癥反應的中心環節。淋巴細胞、中性粒細胞、單核-巨噬細胞的聚集，是炎癥反應發生發展的重要步驟。最新研究表明，多種炎性細胞因子與炎性細胞的浸潤共同使炎性病變進一步發展，導致腦組織中缺血性壞死，腦水腫和神經元損傷加重[4]。早期研究已發現IL-1β中和抗體或其阻斷劑可有效減輕缺血性腦損傷[5]。通過肢體反復預處理，王小琴等[6]發現降低TNF-α和IL-6水平，腦缺血再灌注損傷得到有效緩解，細胞損傷程度減輕、腦梗死體積縮小。黃韜[7]等通過研究發現，高劑量梓醇可以降低腦缺血再灌注大鼠腦組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平，取得一定的療效。因此，從炎癥細胞與炎癥細胞因子入手，抑制免疫損傷，為治療腦缺血再灌注炎癥反應提供靶點與方法。

近年來研究發現基因調控對于疾病的發生發展產生影響。miRNA是一種非編碼RNA，其參與調控細胞能量代謝、生長分化、細胞凋亡等一些重要的細胞生理過程[8]。目前有大量研究探索了生理條件下和缺血性卒中后循環血和腦組織中miRNA的表達分布及作用[9]。miRNA與腦組織生理功能和病變等有著密切關系，它們和靶基因共同參與炎癥、動脈粥樣硬化、神經血管再生、細胞凋亡等多種與缺血性卒中相關的病理生理學過程，這充分表明miRNA可能成為缺血性卒中早期診斷的分子標志物和有效的治療靶標。而circRNA是一種新近研究的非編碼RNA。據報道，環狀RNA在多個器官中富集，在大腦中尤其豐富，這表明環狀RNA可能參與其中腦生理和病理過程[10]。circRNA已被證明與miRNA密切相關，circRNA-miRNA-基因通路對于調節基因表達起著重要作用。但現階段研究尚不清楚circRNA在腦缺血的發病機制中的具體作用。Liu[11]等發現腦缺血再灌注48 h后，有914個circRNA顯著上調，其余113個則顯著下調。隨后選擇三個circRNA，預測相關重要的細胞信號傳導途徑和功能，構建出circRNA-miRNA-靶基因的相互作用網絡。隨著國內外研究發展，發現競爭性內源RNA(ceRNA)[12]也為腦血管疾病研究和治療提供新依據。

2 疾病-靶點網絡的建立

2.1 靶點蛋白PPI網絡構建

通過GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫，以“Cerebral ischemia-reperfusion inflammatory response”為檢索詞，收集抗腦缺血再灌注炎癥反應的作用靶點，以Score值≥30為限定條件進行篩選，得到TNF、IL6、IL10、IFNG、TLR4、IL1B、TGFB1、CXCL8、TP53、ICAM1、APP、MPO、NOS2、PTGS2、CCL2共15個靶點；采用Srting數據庫及Cytoscape軟件Network analyzer功能構建靶點PPI網絡(圖1)。按照“Degree”分析，結果表明通過多個作用靶點可實現抗腦缺血再灌注炎癥反應。

圖1 靶點蛋白PPI網絡圖

2.2 KEGG通路富集分析

利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫及Cytoscape軟件，將15個靶點進行KEGG富集分析，得到圖2，并對P值取負對數，得出“-lgP”，-lgP值越大，富集程度越大，將數據導入Origin，繪制heatmap，得到圖3。KEGG富集分析結果顯示，TNF、IL6、IL10、IFNG等為重要靶點，可通過細胞因子與細胞因子受體的相互作用、沙門氏菌感染、NF-κB信號通路、TNF信號通路等多條通路實現對靶點的調控。

圖2 KEGG通路可視化網絡圖

圖3 熱圖

3 腦缺血再灌注炎癥反應的治療

通過對腦缺血再灌注炎癥反應病理生理機制的研究，發現炎癥級聯反應涉及環節靶點眾多，炎癥細胞與炎癥因子相互錯雜且獨立，靶點之間相互溝通，阻礙治療進程，以往研究多以溶栓為主，他汀類藥物經臨床與試驗研究證明有效；也有學者涉及單靶點受體抑制劑，如IL-1受體拮抗劑，從而人為降低IL-1水平，阻斷級聯反應，減輕腦組織損害；亞低溫治療、干細胞療法也是研究的熱點。

隨著國內外研究水平的提高，氫氣對于多種疾病的治療均具有一定療效。富氫水是氫氣給藥方式之一，明顯縮小腦梗死面積、減輕腦水腫癥狀，張威[13]等研究證明其可下調TNF-α、IL-1β水平，減弱炎癥反應，抑制線粒體凋亡途徑。氫氣醫學尚屬于萌芽階段，仍需進一步探索；常壓高濃度氧治療[14]直接改善缺血腦組織氧合狀態，恢復腦組織氧分壓。核轉錄因子NF-κB參與多種炎性因子轉錄及表達，師文娟等[15]發現常壓高濃度氧治療通過抑制其過度活化，從而防止炎癥反應發生；另外，一定劑量的雷公藤紅素可以抗炎、抗腫瘤、免疫抑制，對腦缺血再灌注后腦血管神經具有保護作用，楊雪蓮[16]等用不同劑量的雷公藤紅素治療腦缺血再灌注后的大鼠，研究其神經保護作用，發現隨濃度增加，炎癥因子釋放減少。苯海索[17]與丙磺舒[18]經研究表明均可抑制炎癥反應，減輕腦組織缺血再灌注后損傷。

4 陰陽學說理論對腦缺血再灌注炎癥反應的認識

4.1 陰陽學說是中醫理論基礎

陰陽學說是研究世間萬物發生發展及其運動變化規律的學說，屬中國古代哲學范疇[19]，是傳統文化的核心思想?！耙滓缘狸庩枴?，陰陽學說是中醫學的基礎理論，《素問·陰陽應象大論篇》道:“陰陽者，天地之道也，萬物之綱紀，變化之父母，生殺之本始，神明之府也，治病必于本”。陰陽交感、對立、互根，消長以及轉化，是人體生理活動及病理變化的規律和基本法則。如精、氣、血、津液是構成人體和維持生命活動的基本物質，其中氣屬陽，精、血、津液屬陰，“陰在內，陽之守也；陽在外，陰之使也”，陰陽保持動態平衡，“形神相得”；陰陽任何一方偏盛偏衰及變化導致陰陽失調，“邪氣盛則實”“精氣奪則虛”則“陰陽離絕，精氣乃絕”?！毒霸廊珪髦忆洝酚性疲骸胺苍\脈施治，必先審陰陽，乃為醫道之綱領”，陰陽學說對于疾病的認識、診斷、治療意義重大。

4.2 缺血性中風與陰陽失調

歷代醫家研究表明，氣血逆亂導致缺血性中風。虛、瘀、痰、毒致使腦脈失榮，閉塞不通，出現神經系統癥狀，甚至死亡。其中以陰陽失調所致的“氣虛”為根本。陽氣為人體生命活動的原動力，張介賓道：“天之大寶，只此一丸紅日；人之大寶，只此一息真陽?！惫湃嗽缭凇渡瞎盘煺嬲摗分姓撌雠印拔迤哧柮髅}衰”“七七任脈虛”而“形壞”，男六七“陽氣衰竭于上”?！肚Ы鸱健芬嘣疲骸叭四晡迨陨?，陽氣日衰，損與日至，心力漸退，忘前失后，興居怠惰，計授皆不稱心?！倍邦^為諸陽之會”，為人之神靈所居，伴隨年齡的增長，陰陽失于調和，陰陽消長轉化失去平衡。“陽主氣，故氣全而神旺；陰主血，故血盛而形強。人生所賴，唯斯而已。”氣為血之帥，“營氣者，泌其津液，注之于脈，化以為血。”“五臟六腑之精，皆上屬于腦”，因此氣虛則血虛，腦脈失榮；又因“運血者，即是氣”，《醫林改錯》云：“血管無氣”故“必停留而瘀”;李東垣有“氣虛致中”學說；張景岳結合自身臨床實踐，提出“元氣虧損”是缺血性中風的主要原因；王清任道:“中風諸癥皆為氣虛所致”。陰陽失衡，氣虛血虛及瘀，出現肢體活動欠佳，言語不利等神經功能障礙。陰陽失調導致氣虛，《血證論·陰陽水火氣血論》中有云：“水化于氣”“氣行水亦行”。津液的生成、輸布和排泄與氣密切相關。氣虛津傷水停，由此形成水濕、痰飲。痰瘀互結于腦脈，《素問·本病論》曰:“久而化郁，……民病卒中偏痹,手足不仁”[20]，痰瘀毒邪久而化熱，瘀熱毒邪互結呈現，使神明蒙蔽，腦絡失養，“瘟毒在內燒煉其血,血受燒煉,其血必凝”[21]，血瘀之證益甚。

4.3 缺血性中風與炎癥反應

不同于西醫，通過辨證論治，瘀熱型為炎癥重要類型?！端貑枴の逍写笳摗酚性疲骸捌渥冄谞q。”這里的“炎”即熱。《內經》中所述“營衛稽留于經脈之中，則血泣而不行；不行則衛氣從之而不通，壅遏不得行，故熱，大熱不止，熱盛則肉腐，肉腐則為膿?！蓖ㄟ^現代醫學同樣發現，血瘀證與炎癥、炎癥因子、微循環等方面密切相關。以中醫傳統理論為核心，結合現代微觀研究，探究血瘀證與炎癥反應發生的內在聯系。馬曉娟[22]等發現血瘀證與C反應蛋白、IL-6、TNF、ICAM等存在密切相關性；活血化瘀法在臨床諸多炎癥的治療中發揮著重要的作用；同樣，以中醫角度來看，缺血性中風所產生的炎癥因子相當于內生毒邪，通過建立熱毒血瘀證模型，發現炎癥因子水平明顯升高。因此，基于以往研究表明缺血性中風以“瘀”為代表，產生炎癥反應。

中老年陽氣虛弱，陰陽失調，氣虛血虛，腦脈失養；又因氣虛導致血瘀，津液生成輸布障礙，形成痰濕，痰瘀互結，郁而化熱，痰、瘀、熱、毒使血瘀證日益嚴重，從內部推動炎癥反應的發生發展。縱觀從陰陽失調到炎癥反應，環環相扣，在每一個環節均可發揮中醫藥優勢，益氣活血、活血化瘀、清熱解毒化濕等方法，為治療腦缺血再灌注炎癥反應提供有效選擇。

5 中醫藥防治

通過對于缺血性腦卒中病因病機的分析，中醫藥運用益氣活血、活血化瘀、清熱解毒等方法對于治療此類疾病具有優勢，其具有多靶點、多環節、雙向調節的特點，近年來各類實驗研究表明，中醫藥存在明顯的療效。

除治療缺血性中風經典方劑補陽還五湯外，諸多復方均有療效。芪蛭通絡膠囊對腦缺血性中風中多種病理因素治療有效，武曉偉[23]等對其進行拆方研究，分為含有水蛭、川芎、土鱉蟲、丹參、郁金、紅花、雞血藤、姜黃、澤蘭9味藥的活血化瘀組，與不含以上九味藥的缺活血化瘀藥味組?；钛鏊幬督M對大鼠腦缺血再灌注損傷具有緩解作用，較缺活血化瘀藥味組腦梗死率、TNF-α、IL-1β均明顯降低。腦心清膠囊同樣也是腦血管疾病的常用藥，閔冬雨[24]等學者對其進行了研究，柿葉為腦心清膠囊的主要成分，柿葉提取物中黃酮、有機酸和香豆素等具有抗炎、抗氧化、改善平滑肌功能的作用，通過實驗研究表明，其有效抑制海馬神經元的損傷，抑制組織氧化應激損傷，降低炎癥因子水平，對于腦血管具有明顯的保護作用。滌痰湯出自《奇效良方》卷一，具有豁痰清熱,利氣補虛之功效，主治中風,痰迷心竅,舌強不能言，是臨床治療中風急性期的常用方劑。相關研究表明[25]其可以抑制體內炎癥反應。加味滌痰湯可以通過干預腦缺血再灌注損傷后的細胞自噬，改善腦缺血再灌注過程中腦組織損傷，降低炎癥因子水平，起到缺血再灌注后神經保護的作用。

對于單味藥及其有效組分的研究，為抑制腦缺血再灌注后炎癥反應開拓了視野。敗醬草，最早出現于《神農本草經》，具有清熱解毒、止血、活血等功效，其入藥部位是黃花敗醬和白花敗醬的全草。研究[26]指出，敗醬草具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。敗醬總黃酮是敗醬草的有效成分，敗醬總黃酮能夠降低腦缺血再灌注模型大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平，起到減輕炎癥反應對腦組織損傷的作用。白藜蘆醇作為多酚類活性物質，主要存在于藜蘆、決明等植物中。研究[27]表明，給予白藜蘆醇后，腦缺血再灌注模型大鼠腦組織中的Caspase-1含量、NLRP3炎癥小體明顯下降，而ZO-1含量明顯增加，這證明白藜蘆醇能夠通過改變NLRP3、Caspase-1、ZO-1水平，從而降低炎癥反應，減輕腦缺血再灌注損傷；另一方面，白藜蘆醇能保護血腦屏障，抑制炎性細胞侵襲腦組織，從而抑制大腦炎癥因子的釋放。另外白芍具有養血斂陰,柔肝止痛,平抑肝陽的功效。芍藥苷是中藥白芍的有效成分，具有抗炎、抗氧化等藥理作用。有研究[28]表明，芍藥苷能夠調控Ca2+/CaMKⅡ/CREB信號通路、抑制神經元凋亡，從而發揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。芍藥苷能顯著降低大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的水平，從而發揮對腦缺血再灌注的抗炎作用。

通過益氣活血、清熱解毒等方法為抗腦缺血再灌注炎癥反應提供有效選擇;同時參與多種炎癥因子的調控。且中醫藥在腦血管疾病中雙向調節的優勢不斷突顯，中醫治療注重“亢者承之，弱者彰之”，在治療中強調“調”字，調節機體寒與熱、虛與實、表與里、陰與陽的矛盾對立面的“證”，這在一定范圍內可使機體內穩態失卻平衡得到改善，使中醫治療腦缺血再灌注炎癥反應取得一定進展。

6 中西醫結合防治思路

6.1 注重腦缺血再灌注炎癥反應的中醫病因病機

氣虛血瘀、瘀毒互結是缺血性中風的基本病機，六淫邪氣、情志因素、飲食因素等皆可導致炎癥反應的發生。諸多因素常常相兼為病。缺血性中風中，以濕熱、瘀熱辨證較多，以陰虛火旺為主要病機。人體差異性較大，素來肝陽上亢者，上實下虛，腦脈受損，產生炎癥反應；血虛者，脈道失于濡養，難以維持內環境平衡，產生炎癥反應；自身正氣不足，容易感受六淫邪氣者，正邪相搏，炎癥反應隨之而來。炎癥反應類型與缺血性中風的病因病機相交叉，則產生諸多新的影響因素，對中醫藥診治帶來極大困難。因此，要征集大數據的樣本資料，兼顧多種致病因素與個體差異性，闡明病因病機，發揮中醫藥治療腦缺血再灌注炎癥反應的優勢。

6.2 注重腦缺血再灌注炎癥反應的病理生理機制

腦缺血再灌注炎癥反應通過多種炎癥細胞、炎癥因子以及相關通路對機體產生損害。針對于目前研究階段，基因研究產生重大突破，但是難以完全闡明其發病機制。而中醫藥具有多環節、多靶點的整體調節作用，與腦缺血再灌注炎癥反應的病理生理特點相符合，通過整體調控，達到療效。結合生物信息學，基于GeneCards數據庫，篩選靶點，結合String及Cytoscape軟件算法分析對功能靶點進行蛋白互作PPI分析，從微觀角度推測抗腦缺血再灌注炎癥反應的靶點與作用機制，同時利用DAVID數據庫，將靶點進行KEGG富集分析，說明TNF、IL-6、IL-10、IFNG等為重要靶點，可通過細胞因子與細胞因子受體的相互作用、沙門氏菌感染、NF-κB信號通路、TNF信號通路等多條通路實現對靶點的調控。有望成為重要治療靶點，為治療腦缺血再灌注炎癥反應提供新的理論依據，有助于中醫藥針對更多的致病因子甚至基因進行同時調控，對于研究中西醫結合防治腦缺血再灌注炎癥反應損傷具有重要意義。

6.3 加強對中醫藥治療腦缺血再灌注炎癥反應的有效物質及機理研究

中醫注重“調”字，通過多途徑，多靶點進行調控，在眾多慢性病中發揮優勢。經驗醫學發現諸多中藥具有一定療效，但是對于藥效物質、組方用藥的配伍原理、治病原理并不十分清楚。單味藥中有效成分是什么，含量占比是多少，是作用于發病的哪一環節，是對于哪一類細胞進行調控，組方用藥藥物配伍的原理是什么，為什么形成最佳配伍比例。諸多問題等待去解決，使中醫藥治療更加具有科學性、準確性、針對性。

6.4 提高治療方案腦靶向性

血腦屏障的存在一定程度上降低藥物療效。通過注射納米激動劑，細胞表面的腺苷A2A受體被激活，使毛細血管內皮細胞緊密性降低，從而提高血腦屏障通透性，提高大分子藥物入腦效率，藥物在腦內分布顯著增加，納米激動劑延長了血腦屏障開啟的時間窗口，增加血腦屏障通透性[29]；外泌體也有望成為腦缺血再灌注診斷新的生物標志物，具備良好的治療潛能。劉辰庚[30]研究表明，外泌體通過跨越血腦屏障將miR-135a這一生物信息傳達至腦細胞內，并發揮其生物學作用。將其與中醫藥相結合，展現中醫藥的強大生命力。

7 總結

腦缺血再灌注損傷的炎癥反應機制復雜，影響因素眾多?；陉庩枌W說理論，合理運用中醫藥的雙向調節作用，通過單味中藥的有效組分或多味中藥配伍，闡明病理生理機制，并且結合現代科學技術，促進藥物透過血腦屏障，加強療效。始終堅持在中醫理論的指導下，運用現代高新技術，勤于研究，為中醫藥的精準醫療提供新思路，為中西醫防治腦血管疾病提供新參考。