基于網絡藥理學和分子對接技術研究人參皂苷Rg1治療阿爾茨海默病的分子生物學機制

盛望，王瑾茜，殷淑婷,2，李旭華，胡國恒,2，謝麗華,2*

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007;2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以認知障礙、行為異常、神經精神癥狀為主要臨床表現的進行性發展的神經系統退行性疾病。世界阿爾茨海默病2018年報告全球約有5 000萬人患有癡呆，且患病人數將逐年上升，預計至2050年，患病人數將增至1.52億;而全球社會與該疾病相關的治療費用每年約1萬億美元，預計到2030年將翻一倍[1]。其病因病機復雜且尚不明確，現代研究表明，年齡、性別、遺傳因素等為AD的主要發病原因[2]，其發病機制假說主要有基因遺傳學說、膽堿能學說、自由基學說、Aβ淀粉樣蛋白學說、炎癥和免疫學說、氧化應激學說、Tau蛋白異常磷酸化假說等[3-4]。目前治療手段以改善臨床癥狀為主，臨床主要予以膽堿酶抑制劑(ChEI)、N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑、淀粉樣前體蛋白B位點分裂酶(BACE)抑制劑等改善患者認知功能，但不能有效的逆轉或阻止病情進展[4]。因此探尋或開發能有效防治AD的藥物研究具有重要意義。人參“補氣，固脫，生津，安神，益智”[5]，人參皂苷Rg1是人參的主要藥效成分之一，陳紅淑等[6]研究發現，人參皂苷Rg1可通過有效提高細胞活力，抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達，從而抑制Aβ誘導的細胞自噬性死亡發揮神經保護作用。李乃靜等[7]研究表明，人參皂苷Rg1不僅可減少AD小鼠海馬組織的Aβ沉積，改善AD小鼠的認知功能，還可通過影響次黃嘌呤、二氫鞘胺醇、十六碳黃嘌呤等水平調節腦代謝，以防治AD。可見，人參皂苷Rg1在防治AD方面具有重要的研究價值。

本研究通過對人參皂苷Rg1作用靶點和AD相關的疾病靶點進行篩選匯總，得出人參皂苷Rg1作用于AD的作用交聯靶點，通過網絡藥理學和分子對接方法，從靶點、信號通路的角度研究人參皂苷Rg1治療AD的作用機制，為進一步闡明其治療AD的藥理作用及機制提供依據。

1 研究方法

1.1 人參皂苷Rg1作用靶點的預測

利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查找人參皂苷Rg1化學結構式，并保存其mol2格式文件。將TCMSP數據庫中下載的人參皂苷Rg1分子結構以mol2格式輸入PharmMapper Server平臺(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)預測其作用靶點，設置人類蛋白靶點作為藥效團映射，并設定返回靶點數為300，得到人參皂苷Rg1相關的靶點名稱、基因名稱、Uniprot ID、匹配值(fit score)等結果，錄入Uniprot(https://www.uniprot.org/)數據庫中檢索，選擇物種為“Homo sapiens”，刪除重復、非人源與不規范的靶點，校正為其官方名稱并摘錄其標準基因名，最終得到人參皂苷Rg1活性成分的作用靶點。

1.2 人參皂苷Rg1作用靶點蛋白互作(PPI)網絡的構建

將1.1預測靶點導入STRING11.0數據庫(https://string-db.org)，限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用域值設為highest confidence≥0.9，其他參數保持默認設置，從而獲得蛋白互作信息。將從STRING11.0數據庫導出的文件中node1、node2和Combined score信息導入Cytoscape3.6.1軟件進行可視化分析，使用Network Analyzer功能對靶點進行分析，節點面積大小及顏色深淺代表度(Degree)值的大小，并得到網絡分析結果。

1.3 人參皂苷Rg1作用AD相關靶點的收集及PPI網絡構建

以“阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)”作為檢索詞，通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、CTD數據庫(https://ctdbase.org/)查找與AD相關靶點，每個數據庫選擇相關度前300的靶點作為慢性胃炎疾病靶點進行研究，合并2個數據庫，去除重復基因和假陽性基因，將所得AD相關靶點與人參皂苷Rg1活性成分作用靶點通過VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)得出共同靶點，即為人參皂苷Rg1治療AD的作用靶點。將共同靶點導入STRING11.0數據庫，選擇研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用域值設為highest confidence≥0.4，獲得靶點聯系網絡圖，將該圖進一步導入Cytoscape3.6.1軟件構建PPI網絡。

1.4 人參皂苷Rg1作用AD的GO富集分析與通路注釋分析

將人參皂苷Rg1治療AD的作用靶點以Gene Symbol的格式導入DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，分別選擇生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function, MF)和細胞成分(cellular component, CC)進行基因本體(GO)富集分析，選擇KEGG進行靶點基因通路注釋分析，并且使用GraphPad Prism 8軟件將GO富集分析滿足PValue<0.05的結果做成可視化條形圖。使用Omicshare(https://www.omicshare.com/)將KEGG分析滿足PValue<0.05的結果制成可視化氣泡圖。

1.5 人參皂苷Rg1與其作用AD靶點之間分子對接驗證

利用RCSB PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)查找篩選出的45個靶點的晶體結構，利用ZINC數據庫(http://zinc.docking.org/)查找篩選出的人參皂苷Rg1的Mol2結構式，將活性成分的Mol2結構式與PDB ID形式的靶點導入AutoDock軟件，對活性成分和靶標蛋白進行虛擬分子對接分析。結合能小于0說明配體與受體可自發結合，目前對活性分子篩選尚無統一標準，根據文獻報道[8]，這里選取結合能≤-5kJ/mol的成分作為人參皂苷Rg1治療AD的有效成分評價標準。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg1潛在靶點信息

根據PharmMapper Server數據庫查找人參皂苷Rg1靶點，刪除重復靶點及經Uniprot數據庫校正后得到潛在靶點284個及其對應的標準的基因名，其中highest confidence≥0.9靶點有203個。人參皂苷Rg1靶點相互作用見圖1，其中，節點顏色越深對應面積越大，代表度值越大。度值表示該靶點與其他作用靶點的關聯個數，度值越大表明該靶點在網絡中的作用越重要，度值排名前10的靶點分別為MAPK1、SRC、PIK3R1、AKT1、RXRA、HRAS、GRB2、MAPK14、PTPN11、HSP90AA1，且均可作用于20個以上的靶點，說明這些靶點在人參皂苷Rg1作用網絡中具有重要作用，關系網絡中節點詳細信息見表1(僅列靶點度值的前30個靶點)。

表1 人參皂苷Rg1蛋白互作拓撲學分析(度值排序前30個靶點)

圖1 人參皂苷Rg1蛋白互作網絡

2.2 AD相關靶點數據庫構建及對比分析

在GeneCards、CTD數據庫共篩選31 274個靶點，根據相關度每個數據庫取前300個靶點組建AD相關靶點數據庫，VENNY2.1軟件從AD相關靶點與人參皂苷Rg1作用靶點兩組數據中共得到45個共同靶點作為人參皂苷Rg1治療AD的作用靶點。人參皂苷Rg1與AD相關發病機制靶點韋恩圖，見圖2。人參皂苷Rg1對AD作用靶點的PPI網絡關系，見圖3。人參皂苷Rg1對AD作用靶點的蛋白互作網絡的拓撲學分析，見表2。經Network Analyzer分析網絡拓撲學屬性發現，該PPI網絡中聚類系數為0.683，平均節點度為17.644，平均最短路徑1.07～2.23，介數中心性在0～0.13。該45個共同靶點是人參皂苷Rg1與疾病作用的關鍵分子基礎，并在關系網絡中體現了較好的聯通特性。其中，ALB、AKT1、MAPK1、CASP3、EGFR、MAPK8、MMP9、HSP90AA1、SRC、ESR1、MAPK14均可與25個及以上靶點相互聯系，提示這些靶點可能是人參皂苷Rg1治療AD的重要靶點。

表2 人參皂苷Rg1對AD作用靶點的拓撲學分析

圖2 人參皂苷Rg1靶點與AD相關發病機制靶點韋恩圖

圖3 人參皂苷Rg1對AD作用靶點的PPI網絡關系

2.3 人參皂苷Rg1對AD作用靶點的GO富集分析與通路注釋分析

根據1.4中的分析方法，GO富集分析在生物過程、分子功能、細胞成分三個方面，分別得到42個條目，24個條目，14個條目，分別取前10個條目做成可視化條形圖，如圖4。KEGG通路注釋分析共分析出78條信號轉導通路，將前20條通路做成可視化氣泡圖，如圖5，其中涉及10條通路與AD相關，分別是Estrogen signaling pathway(雌激素信號通路)、Prolactin signaling pathway(催乳素信號通路)、ErbB signaling pathway(跨膜酪氨酸激酶信號通路)、FoxO signaling pathway(FoxO信號通路)、TNF signaling pathway(腫瘤壞死因子信號通路)、GnRH signaling pathway(促性腺激素釋放激素信號通路)、HIF-1 signaling pathway(缺氧誘導因子-1)、VEGF signaling pathway(血管內皮生長因子信號通路)、PPAR signaling pathway(過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路)、Insulin resistance(胰島素抵抗)。

圖4 人參皂苷Rg1對AD作用靶點的GO富集分析

圖5 人參皂苷Rg1對AD作用靶點的KEGG分析氣泡圖

3 分子對接結果

應用AutoDock軟件對篩選出的人參皂苷Rg1與其作用AD的45個靶點進行對接，一般認為配體與受體的結合能越低，其結合構象越穩定，發生的作用可能性越大，本研究中，與人參皂苷Rg1結合能最低的蛋白分別為CTSB(結合能為-38.53 kJ/mol)、BCHE(結合能為-33.47 kJ/mol)、AKT1(結合能為-28.16 kJ/mol)。以-5 kJ/mol為評價標準，可知人參皂苷Rg1與CTSB、BCHE、AKT1、MMP3、EGFR、IL2、TTR、CTSD、NQO1、PPARG等41個靶點結合能均小于-5 kJ/mol，提示人參皂苷Rg1與預測的AD作用靶點有較好的結合活性。具體見表3，人參皂苷Rg1與結合能前6靶點的結合模式見圖6。

表3 人參皂苷Rg1對AD作用靶點分子對接結果

圖6 人參皂苷Rg1與部分靶點分子對接模式

4 討論

根據圖1人參皂苷Rg1蛋白互作網絡顯示，通過篩選后得到284個人參皂苷Rg1潛在的靶點，其中highest confidence≥0.9靶點有203個，圖3顯示人參皂苷Rg1作用AD的靶點有45個。根據圖4人參皂苷Rg1對AD作用靶點的GO富集分析發現，與細胞自噬相關的靶點有PPARG、STAT1、PPARA，其中，PPARA/α 是過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的一種轉錄因子，主要調節脂肪酸的代謝，Rongcan Luo等[9]研究發現PPARA激動劑有助于降低阿爾茨海默病模型小鼠海馬和皮質組織中的β-淀粉樣蛋白(Aβ)水平，促進小膠質細胞和星形膠質細胞向Aβ斑塊附近募集以增強自噬反應，改善小鼠記憶力和焦慮癥狀。與血脂調節有關的靶點包括ESR1、NR3C1、NR1H3、PPARA、PPARG，Avik Roy等[10]通過他汀類藥物與PPARA配體結合域結合后發現可激活PPARA介導的cAMP反應元件結合蛋白(CREB)的轉錄，以增加神經營養因子的表達，上調神經營養蛋白，改善阿爾茨海默病模型小鼠的神經營養功能及記憶力。與tau蛋白過度磷酸化相關的靶點有MAPK1、MAPK14、GSK3B，絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞的增殖、分化、凋亡等生物過程[11]，p38MAPK的定位和激活與tau磷酸化呈正相關，其抑制作用是通過抑制p38抑制神經元細胞中的Tau病理學、降低Aβ誘導的神經毒性的化合物以對Aβ誘導的神經元損傷起到神經保護作用、抑制小膠質細胞和星形膠質細胞中的p38MAPK途徑減少神經炎癥、抑制p38改善神經突觸可塑性等途徑減輕AD癥狀[12]。此外，通過GO富集分析可知，與腦代謝有關的靶點包括MMP9、CTSB、MMP2、MMP13、MMP1，與炎性反應有關的靶點有PPARA、IL2、NR1H3，與氧化應激有關的靶點NOS3、SOD2、NOS2，與細胞凋亡相關的靶點有IGF1R、CASP3、ALB、GSK3B、MMP9、SRC，與晝夜節律性相關的靶點有PPARA、PPARG、GSK3B、NOS2。

如圖5所示，對人參皂苷Rg1作用AD的45個靶點進行KEGG通路注釋分析。得到10條通路與AD相關。雌激素為一種性激素，已有研究表明，機體內雌激素水平與AD的發病率有明顯有關[13]。雌激素可通過調控ERs轉錄因子啟動基因轉導，減少Aβ生成，增加Aβ降解、抑制tau蛋白累積及異常磷酸化或激活MAPK信號通路等途徑發揮神經元保護作用，在防治AD方面具有一定前景[14]。PPARs由PPARα、PPARβ和PPARγ三種亞型組成，是調節靶基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員之一，Lourenco等研究表明， PPARγ激活后可直接與類視黃醇X受體(RXR)結合促進RXR蛋白的基因轉錄表達以調節小膠質細胞功能，增強對Aβ的吸收，亦可調節PPAR基因表達激活ERK/MAPK信號轉導以促進小膠質細胞吸收Aβ，此外，還可通過提高胰島素敏感性，減輕炎癥反應等途徑改善AD認知功能[15]。血管內皮生長因子(VEGF)具有促進血管內皮細胞增殖、神經營養和保護神經元的作用，廣泛參與在神經系統疾病的發病過程[16]。研究表明，VEGF可通過促進血管生成、保護血管完整性以抑制Aβ誘導的內皮細胞凋亡，從而改善AD模型的記憶行為[17]。此外，VEGF還可通過關聯PI3K/AKT信號通路、HIF-1α、FoxO3a等途徑抑制Aβ誘導的細胞凋亡、抑制tau蛋白過度磷酸化、抑制內皮細胞凋亡、保護神經元[18]。VEGF信號通路與ErbB信號通路相互交叉，屬VEGF超家族家員之一的神經調節蛋白-1(Nrg1)可通過與ErbB蛋白受體酪氨酸激酶結合進行多種生物學過程。上調Nrg1-ErbB信號通路可通過抑制氧化應激、減輕細胞凋亡、抵抗Aβ的積累等途徑在AD的發病過程中起到保護神經元的作用[19]。

本研究基于網絡藥理學對人參皂苷Rg1在治療AD的作用機制進行探討，發現人參皂苷Rg1可能通過作用于CTSB、BCHE、AKT1、MMP3、EGFR、IL2等45個與AD相關的潛在靶點，調節細胞自噬、保護神經元、營養神經、抑制細胞凋亡、減少炎癥反應、抗氧化應激、改善腦代謝等多種途徑以減少Aβ的積累、抑制tau蛋白累積及異常磷酸化、減輕內皮細胞及神經元損傷發揮改善AD癥狀的作用。而分子對接結果提示人參皂苷Rg1與其作用AD的靶點結合活性較好，為本研究預測的真實性提供科學依據。