熒光蛋白及其在微生物過程工程中的應用研究

劉軒卓

摘? 要：熒光蛋白（Fluorescentprotein）的分離應用為現代工業的發展起到了至關重要的作用，其是一類可在紫外光激發下產生熒光的發光蛋白，較為常見的有綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein，簡稱GFP）、藍色熒光蛋白（Bluefluorescentprotein，簡稱BFP）、青色熒光蛋白（Cyanfluorescentprotein，簡稱CFP）、黃色熒光蛋白（Yellowfluorescentprotein，簡稱YFP）、紅色熒光蛋白（Redfluorescentprotein，簡稱RFP）等。熒光蛋白的熒光穩定性較好，而且靈敏度很高，因此應用較為廣泛，尤其是在生物學的眾多領域都有應用。本文將從熒光蛋白的基礎理論、在微生物過程工程中的應用現狀包括應用范圍、應用方法以及未來的發展趨勢等方面做綜述，為后續熒光蛋白更加廣泛的應用提供一定的參考。

關鍵詞：熒光蛋白? 微生物? 過程工程? 應用研究

中圖分類號：Q93? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1674-098X（2020）08（b）-0091-03

Abstract： Fluorescent protein separation application plays a vital role for the development of modern industry. It is a kind of Fluorescent protein that can produce fluorescence under UV excitation. More common are Green fluorescent protein （GFP）， Blue fluorescent protein （BFP）， Cyan fluorescent protein （CFP）， Yellow fluorescent protein （YFP）， Red fluorescent protein Protein （RFP）， etc. Fluorescent proteins have good fluorescence stability and high sensitivity， so they are widely used， especially in many fields of biology. In this paper， the basic theory of fluorescent protein， the application status in microbial process engineering， including the application scope， application methods and future development trend will be reviewed， so as to provide some references for more extensive application of fluorescent protein in the future.

Key Words： Fluorescent protein; Microbes; Process engineering; Application research

熒光蛋白最初于1992年自水母體內克隆而來，其熒光特質可以有效地揭示生物分子的運動規律及其基因本質，借助此特性可應用于基因的表達調控、生物分子相互作用、蛋白質中蛋白折疊、蛋白間信號傳導以及各種生物蛋白酶活性分析等[1]。目前已經分離出的熒光蛋白分布于整個可見光區，主要有綠色、藍色、青色、黃色以及紅色熒光蛋白[2]。每種熒光蛋白的應用特性各有不同，可應用于目的細胞的篩選、細胞內狀態表征等方面。

1? 熒光蛋白

熒光蛋白的應用由來已久，其應用屬性主要集中在熒光蛋白的亮度、Stokes位移（激發峰與發射峰之間的距離）、光譜特性的優化、新型光轉換與光激活熒光蛋白等方面[3]。綠色熒光蛋白是最早分離出的熒光蛋白，在波長300～500nm的激光激發下可發出綠色熒光。其在水母中發現，水母素在鈣刺激下發光，其能量可轉移到GFP，刺激GFP發光。由于其生色團的形成沒有物種特異性，易于引發突變，且對于pH值較為敏感，易形成對應的二聚體，從而拓寬其應用價值[4]。青色熒光蛋白其熒光屬性僅次于綠色熒光蛋白。藍色熒光蛋白分離于野生珊瑚，其熒光量子產率較低，穿透力較弱且容易對細胞產生傷害，應用較少。黃色熒光蛋白相對穿透力較強，可應用于成像方面。紅色熒光蛋白可與橙色熒光蛋白配對使用從而實現對于細胞內的雙成像，使得兩種分子事件可以同步實現。熒光是熒光蛋白最特別的特點，而其中的發色團起著主要的作用。在α-螺旋上的65、66、67位氨基酸——絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸經過環化、脫氫等作用后形成發色團。有意思的是，發色團形成過程是由外周柵欄上的殘基催化，底物只需要氧氣。這暗示綠色熒光蛋白被廣泛用于不同物種的潛力：在不同物種中能獨立表達成有功能的蛋白，而不需要額外的因子。

2? 熒光蛋白應用于目的細胞篩選

熒光蛋白主要的應用是微生物的篩選。熒光蛋白與熒光素/熒光素酶不同，無需任何輔助因子，只需藍光照射便能自發光，而且傳統熒光因子發光時會產生光毒性，導致細胞死亡，而熒光蛋白毒性較弱，適合標記活體細胞及組織。與目的基因組成融合蛋白或通過IRES或2A與感興趣的蛋白共表達，可將熒光蛋白定位到特定的細胞器或膜系統中。將熒光蛋白基因連接到目的基因啟動子之后，通過測定熒光強度便可對該基因的表達水平進行檢測。或者，將熒光蛋白作為標簽與主體蛋白融合，可檢測蛋白質分子的定位、遷移、構象變化以及分子間的相互作用，這也是熒光蛋白最成功的應用之一。而在細胞生物學與分子生物學的應用中，綠色螢光蛋白（GFP）基因常用做報告基因（reportergene）。綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物（例如：兔子）上進行表現，并拿來映證某種假設的實驗方法。通過基因工程技術，綠色螢光蛋白（GFP）基因能轉進不同物種的基因組，在后代中持續表達。生物育種篩選使用DNA重組以及改組技術已經日漸成熟，通過編輯篩選從而取得具有特定目的的基因，實現一定功能。熒光蛋白基因片段較短，因此在構建表達載體時配錯幾率小，比傳統的方法更加快速有效[5]。

3? 熒光蛋白應用于細胞內狀態表征

細胞內狀態與其蛋白質構象密切相關，明確蛋白質的構象就可以對細胞內的狀態有清晰的認識。如部分科學家通過篩選和建立模型，可以有效篩選出錯誤基因，構建出基因表達路徑及對應數據庫，從而有效阻止蛋白質錯誤折疊，讓細胞內蛋白質狀態正確表達。如紅色熒光蛋白其生色團發光較為明顯，可以通過對目標蛋白的融合而顯示出對應細胞內蛋白的結構是否錯誤折疊。綠色熒光蛋白對于pH值較為敏感，可以將綠色熒光蛋白植入需觀察的細胞內，通過其熒光變化從而監測細胞內的pH變化，為其他研究奠定基礎。

4? 熒光蛋白應用方法

熒光蛋白的應用日漸廣泛，如何正確且高效的選用對應蛋白至關重要。如熒光蛋白與目標蛋白的融合表達受其單體性質影響，若想直接地追蹤目標蛋白或是定位目標蛋白，則要求熒光蛋白是單體，不能影響目標蛋白的功能和定位，此時將熒光蛋白的單體性質放在首位。當前體外檢測熒光蛋白單體性質的方法有分子篩法、沉降平衡法等，可以通過熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄，單一粗略的判斷其是否為單體，而沉降平衡法能夠更加準確地確認其聚合性質。熒光蛋白的使用幾乎都是在細胞內或組織內，在生理條件下熒光蛋白的聚合性質關系到目的細胞篩選的成功與否。在選擇熒光蛋白時，還要考慮目標蛋白定位環境的pH值，再考慮使用相應的熒光蛋白[6]。此外，熒光蛋白在發光之前需要經歷轉錄、翻譯、折疊等步驟，其中折疊過程占據了大部分時間，此過程稱之為成熟時間。在標記短壽命的目標蛋白時，如果熒光蛋白的成熟時間太長，可能會出現在目標蛋白開始降解時，熒光蛋白還沒有發光，導致無法追蹤及定位目標蛋白。因此在選擇熒光蛋白時，亦需要考慮其成熟時間。

5? 討論與展望

當微生物研究深入至分子學領域時，可以通過改良基因，篩選特定基因等方法優化熒光蛋白的應用。如通過檢測植物病原菌內部的基因表達，研究進行抗病基因如何表達，熒光蛋白起表達作用。通過實時顯示病原菌與植物的相互作用，從而研究出對應的抗病菌類。目前各類熒光蛋白的研究應用較為深入，根據不同熒光蛋白的特性，其對應的研究領域已基本明了，并取得了一定的成果。但是在活體成像、蛋白間相互作用等研究方面仍有一定的發展空間。而且由于熒光蛋白能穩定在后代遺傳，并且能根據啟動子特異性地表達，在需要定量或其他實驗中慢慢取代了傳統的化學染料。更多的熒光蛋白被改造成了不同的新工具，既提供了解決問題的新思路，也可能帶來更多有價值的新問題。細胞篩選現處于研究成果多發階段，熒光蛋白的應用具有深遠的發展前景，但同時存在一定的局限性。

參考文獻

[1] 楊曉玫，師尚禮，姚拓，等.接種紅色熒光蛋白標記根瘤菌對苜蓿幼苗生長及結瘤能力的影響[J].草原與草坪，2019，39（4）：78-84.

[2] 史志丹，宋培玲，郝麗芬，等.綠色熒光蛋白在植物與病原菌互作研究中的應用[J].北方農業學報，2019，47（6）：68-72.

[3] 劉春，陳曉虹，姜蘭，等.鮰愛德華氏菌的紅色熒光蛋白標記及其應用[J].江蘇農業學報，2019，35（3）：661-666.DOI：10.3969/j.issn.1000-4440.2019.03.022.

[4] NguyenAW，DaughertyPS.EvolutionaryoptimizationoffluorescentproteinsforintracellularFRET.NatBiotechnol，2018（23）：355-360.

[5] 陳彩玲，毛丙永，崔樹茂，等.綠色熒光蛋白標記植物乳桿菌及其生物學特性分析[J].食品與發酵工業，2019，45（20）：22-28，34.

[6] 董小娜，陳澤慧，毛林強，等.微生物溶藻進程與機制的三維熒光分析方法[J].環境化學，2018，37（6）：1337-1342.