基于PI3K/Akt通路的冠心病痰瘀互結證大鼠發病機制研究*

高 杉，王鵬偉，馮 曼，王 朔，李 琳，潘 曄，劉昳佳，于春泉

（天津中醫藥大學，天津 301617）

冠心病（CHD）是由于冠狀動脈粥樣硬化引起的心血管疾病，嚴重危害人類健康，是世界衛生組織（WHO）公認的全球死亡的主要原因[1]。中醫將其歸為“胸痹”“真心痛”等范疇，其病機“痰”“瘀”“虛”貫穿疾病發展始末，早期“熱”“毒”相對較重，后期則由實轉虛，末期多發展為血瘀、水飲和氣陰兩虛虛實夾雜之證[2-3]。近10年，中國將冠心病按中醫證型分類，其中虛證以氣虛證、陰虛證多見，實證以血瘀證、痰濁證居多。血瘀和痰濁是致病因素，同時又是CHD重要的病理產物，兩者多相兼為病，而導致痰瘀互結之證[4]。有文獻調研顯示，近年痰瘀互結證患者人數逐年增加[5]，開展CHD痰瘀互結證的發病機制研究對防治CHD具有重大意義。課題組前期通過在高脂飼料喂養的基礎上聯合冠狀動脈左前降支結扎的方法成功建立CHD痰瘀互結證大鼠模型[6]，本實驗以前期實驗模型為基礎，通過檢測絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關的促凋亡蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達情況，進一步探討CHD痰瘀互結證的發病機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠，體質量180～220 g，由北京維通利華動物實驗中心提供，動物合格證編號：SCXK（京）2016-001。飼養于天津市南開醫院實驗動物中心。

1.2 實驗主要試劑與儀器 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記測定（Tunel）試劑盒購自瑞士 Roche公司；Akt抗體、p-Akt抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Caspase-3抗體均購自 Cell signal technology公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（Thermo公司）、渦旋振蕩儀（其林貝爾儀器制造有限公司）、低溫高速離心機（Eppendorf公司）、電泳儀（美國GE公司）、轉膜儀（美國GE公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及模型制備 大鼠實驗期間保持自由飲水和進食，飼養環境溫度為（24±1）℃，濕度為55%±5%，實驗前適應性喂養1周。根據隨機數字表將115只大鼠分為空白組（15只）、假手術組（20只）、痰濁組（20只）、血瘀組（30只）、痰瘀互結組（30只）。空白組、假手術組和血瘀組用普通飼料喂養8周。痰濁組和痰瘀互結組用高脂飼料喂養8周，第49天目內眥取血，剔除血脂未升高的大鼠。第54天，血瘀組和痰瘀互結組行冠狀動脈左前降支結扎術，假手術組只穿線，不結扎。實驗過程中剔除不符合標準的大鼠，并記錄死亡情況。

1.3.2 標本采集與處理 8周末大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血后生理鹽水沖洗心臟，剪取心臟，-80℃冰箱保存待測。

1.3.3 Tunel染色法觀察大鼠心肌凋亡情況 取心臟組織，進行石蠟包埋、切片，依據Tunel試劑盒說明書操作，光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌細胞凋亡情況。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測心肌組織 Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 蛋白表達情況 取適量左心室心肌組織，按照心肌組織質量∶裂解液體積=1∶10的比例加入配置好的裂解液，冰上勻漿。然后13 000 r/min、4℃離心15 min。離心完成后取上清分裝保存。采用BCA法進行蛋白定量測定，計算上樣量，100℃水浴變性10 min，冷卻后保存于-20℃冰箱中。用移液槍將蛋白標記物（Marker）及待測樣品依次加入到加樣孔內，電泳1 h，切膠，將蛋白轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，TBST漂洗2 min，用5%脫脂奶粉室溫封閉，置于搖床上，輕搖1 h。吸盡封閉液，加入一抗，4℃過夜。次日回收一抗，加TBST洗液3次，每次5 min。吸盡洗液，加入二抗，孵育2 h，之后洗滌3次，每次5 min。最后用ECL化學發光顯示，收集圖片，Image J程序對條帶上的灰度值進行統計，從而進行定量分析。

1.4 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（）表示，進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗后，多組間比較使用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tunel染色 空白組和假手術組未見明顯細胞凋亡，與假手術組相比，痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組大鼠心肌細胞凋亡數目增加，痰濁組大鼠心肌可見少量細胞凋亡，血瘀組和痰瘀互結組大鼠心肌組織存在大量細胞凋亡。見圖1。

圖1 大鼠心臟病理結構變化的影響（Tunel，×100）Fig.1 Pathological changes in the cardiac tissue of rats(Tunel，× 100)

2.2 心肌組織蛋白表達變化 與假手術組相比，空白組大鼠Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值無統計學差異，p-Akt蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；血瘀組和痰瘀互結組大鼠Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；Bax和Caspase-3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05或 P＜0.01）；痰濁組大鼠 p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.05），Akt、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 蛋白表達無統計學差異；痰濁組和血瘀組大鼠Bax/Bcl-2比值無統計學差異，但具有升高趨勢，痰瘀互結組大鼠Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.05）。與痰濁組相比，血瘀組p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.01），Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達和 Bax/Bcl-2比值無統計學差異，但Akt、Bcl-2蛋白表達有降低趨勢，Bax、Caspase-3蛋白表達和Bax/Bcl-2比值有升高趨勢；痰瘀互結組Akt和p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），Caspase-3蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。與血瘀組相比，p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.05），Caspase-3蛋白表達明顯升高（P＜0.05），Bax、Bcl-2 蛋白表達水平和 Bax/Bcl-2 比值無統計學差異，但Bax蛋白表達和Bax/Bcl-2比值有升高趨勢，Bcl-2蛋白表達有降低趨勢。見圖2-7。

3 討論

圖2 心肌組織Akt蛋白表達（）Fig.2 Expression of Akt protein in the myocardial tissue of rats（）

圖3 心肌組織Bax蛋白表達（）Fig.3 Expression of Bax protein in the myocardial tissue of rats（）

圖4 心肌組織p-Akt蛋白表達（）Fig.4 Expression of p-Akt protein in the myocardial tissue of rats（）

圖5 心肌組織Bcl-2蛋白表達（）Fig.5 Expression of Bcl-2 protein in the myocardial tissue of rats（）

CHD屬中醫“胸痹”范疇，《金匱要略·胸痹心痛氣短脈證治》中記載：“師曰：夫脈當取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛，所以然者，責其極虛也。”提出胸痹的病機為“陽微陰弦”，中醫證型多屬本虛標實，虛實夾雜的復合證型[7]。《癥因脈治》云：“胸痹之因，飲食不節，饑飽損傷，痰凝血滯，中焦混濁，則悶食悶痛之癥作矣。”表明“痰濁”和“血瘀”為CHD重要的致病因素。鄧鐵濤教授認為CHD屬本虛標實痰瘀相關的病機，本虛主要為心陰、心陽虛，標實主要為痰與瘀[8]。《素問·奇病論》云：“食甘美而多肥也。”《素問·痹論》云：“飲食自倍，腸胃乃傷。”脾為生痰之源，飲食不節或過食肥甘厚味，則內傷脾胃，脾失健運，氣血津液生化障礙，進而導致水濕內停，聚而生痰，脾胃損傷，氣血生化無源，中氣不足，氣血運行不利，日久則瘀，瘀血阻滯又可引起氣機不暢，致體內津液代謝障礙，痰瘀互生，兩者相互影響，進而形成痰瘀互結的證候造成血流緩慢、血管堵塞引發CHD[9-10]。CHD痰瘀互結證病程較長，病勢纏綿難愈，由此可見，對于CHD痰瘀互結證的研究已更為迫切。

西醫認為CHD的發病是一個極其復雜的過程，其中幾種較為公認的發病學說包括脂肪浸潤學說、血栓形成和血小板聚集學說、內皮損傷反應學說和平滑肌克隆學說。內皮損傷與動脈粥樣硬化緊密相連，而動脈粥樣硬化又是CHD的最基本病理變化。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt作為細胞內重要的信號轉導通路之一，可調節下游效應分子的活化狀態，發揮凋亡作用。細胞凋亡會進一步損傷內皮功能，導致動脈粥樣硬化的發生和發展[11]。

圖6 心肌組織Bax/Bcl-2蛋白表達（）Fig.6 Expression of Bax/Bcl-2 protein in the myocardial tissue of rats（）

圖7 心肌組織Caspase-3蛋白表達（）Fig.7 Expression of Caspase-3 protein in the myocardial tissue of rats（）

Akt是PI3K下游作用的主要介質，通過協調各種細胞內信號和控制細胞對外部刺激的反應來調節細胞增殖和存活。在活化的PI3K/Akt途徑中，PI3K和Akt的表達和磷酸化水平顯著提高，可以抑制磷酸酶和張力蛋白同源物對血管平滑肌細胞存活的抑制作用，使細胞增殖率增加，細胞凋亡水平降低，從而保護心肌細胞免受傷害[12]。另有研究顯示Akt的磷酸化調節可以影響PI3K/Akt/內皮型一氧化氮合酶（eNOS）信號傳導途徑和eNOS去磷酸化，誘導主動脈環的擴張，通過PI3K/Akt/eNOS信號傳導途徑增強了eNOS釋放，導致血管舒張反應[13]。

心肌細胞富含線粒體，線粒體途徑是細胞凋亡信號傳導途徑中最重要的途徑之一，線粒體介導的凋亡在CHD心肌損傷的發病機制中起著至關重要的作用。Bcl-2家族蛋白是此途徑中的關鍵因子，Bcl-2和Bax蛋白均屬于Bcl-2家族，此類蛋白表達水平的高低與凋亡調控直接相關[11，14-15]。LIU等[16]通過實驗研究發現，大鼠心臟缺血再灌注會降低Bax和Caspase 3蛋白的表達，增加Bcl-2的表達，誘導心肌細胞凋亡，從而損傷心臟，引發功能障礙。

在本次實驗中，Tunel染色結果顯示痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組心肌細胞均有明顯凋亡現象，血瘀組和痰瘀互結組心肌細胞凋亡較重。提示痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組具有不同程度的心肌損傷，其中血瘀組和痰瘀互結組損傷程度較重，痰濁組損傷程度較輕。血瘀組和痰瘀互結組大鼠Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；Bax和Caspase-3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；痰濁組大鼠p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.05），痰瘀互結組大鼠Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.05），結果提示痰濁組、血瘀組和痰瘀互結組大鼠心肌細胞都有不同程度的凋亡，其中痰瘀互結組細胞凋亡損傷最重。研究表明細胞凋亡可能是CHD痰瘀互結證的發病機制之一。