流式細胞術(shù)檢測HLA-B27陰陽性判讀標準的建立及灰區(qū)樣本的基因型分析

吳蓓穎， 顧燕英， 范臻佳， 蔡 剛

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025）

流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是目前檢測人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-B27最常用的方法，其檢測速度較快、通量較大。然而，在實際工作中，許多實驗室發(fā)現(xiàn)以試劑盒推薦的臨界值判斷患者HLA-B27的陰、陽性，與患者基因型相對照，會漏檢相當一部分HLA-B27陽性的患者[1]。流式反向序列特異性寡核苷酸探針（flow reverse sequence specific oligonucleotide，F(xiàn)low-rSSO）法分型的錯誤率為0.159%，低于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的分型錯誤率（0.684%）[2]。因此，本研究擬結(jié)合FlowrSSO的分型結(jié)果來設(shè)定FCM檢測HLA-B27的陰、陽性判讀規(guī)則，以及對灰區(qū)樣本的進一步處理方式，并探討灰區(qū)樣本的特性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年8月—2018年5月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院骨科、傷科、康復(fù)科門診就診的腰背關(guān)節(jié)痛患者132例，其中男69例、女63例，年齡17～82歲。

1.2 儀器與試劑

FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）及配套HLA-B27（HLA-B27 FITC/CD3 PE）檢測試劑。Luminex 200多功能流式點陣儀（美國One Lambda公司）及配套HLA-B分型試劑。ABI 9700 PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集所有對象靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。抗凝全血2～8 ℃保存不超過1周。分離的樣本DNA -18 ℃保存不超過2年，-70 ℃可長期保存，避免反復(fù)凍融。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測 取50 μL抗凝血，加入30 μL HLA-B27熒光抗體，室溫孵育30 min，加入2 mL溶血素，室溫放置15 min以裂解紅細胞，300×g離心5 min，棄上清，用2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌細胞2遍，加500 μL PBS重懸細胞，上機檢測，以CD3-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的T淋巴細胞設(shè)門，獲取10 000個細胞，采用配套軟件進行分析，計算細胞HLA-B27的平均熒光強度，與試劑盒提供的臨界值進行比較，以低于臨界值判定為陰性，高于臨界值10以上為陽性，高于臨界值0～10判定為灰區(qū)。以d值（熒光強度的均值與校準磁珠中位值的差值）大小來判斷樣本的陰、陽性。

1.3.3 Flow-rSSO法檢測 提取每份樣本的全血基因組DNA，采用多重PCR進行擴增，將產(chǎn)物與包被了特異性寡核苷酸探針的磁珠雜交，洗脫非特異性結(jié)合的DNA，重懸磁珠，采用Luminex 200多功能流式點陣儀檢測，并用配套軟件分析患者HLA-B位點的基因分型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2016及SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析。用GLM相關(guān)性分析評估不同型別B27與熒光強度的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FCM與Flow-rSSO法檢測結(jié)果的比較

132例患者按FCM試劑盒推薦的陰陽性判讀規(guī)則得出的HLA-B27結(jié)果分別為陰性（d＜0）63例（47.74%）、灰區(qū)（d值為0～10）45例（34.09%）、陽性（d＞10）24例（18.18%）。采用Flow-rSSO法檢測132例患者的基因型，結(jié)果顯示，63例FCM陰性樣本中有28例（44.4%）基因型為B27，其余35例均為其他型別的HLA-B基因型；45例FCM灰區(qū)樣本基因型均為B27，24例陽性樣本2種方法檢測結(jié)果一致，因此FlowrSSO法的陽性率為73.48%（97/132）。

2.2 FCM判讀規(guī)則的擬定

以Flow-rSSO法檢測結(jié)果為HLA-B27××作為HLA-B27陽性的判斷標準。FCM以可以判定全部結(jié)果為非B27的道數(shù)為陰性，以可以判定全部結(jié)果為B27的道數(shù)為陽性，不能明確結(jié)果的道數(shù)范圍擬定為灰區(qū)。見表1。

表1 FCM不同d值結(jié)果與Flow-rSSO法結(jié)果的比較及灰區(qū)擬定

2.3 d值重復(fù)性實驗

選取20個FCM道數(shù)分布在83～186范圍內(nèi)的樣本進行d值重復(fù)性實驗，所有樣本的檢測d值的差值均≤2，故將灰區(qū)的d值上、下界限各擴大2。見圖1。

圖1 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.4 3種判定規(guī)則判定效能的比較

以Flow-rSSO法基因分型檢測的結(jié)果作為判讀標準，比較FCM試劑盒推薦的陰陽性判定值（0≤d≤10）、擬定灰區(qū)判讀規(guī)則（-5＜d≤0）及擴大擬定灰區(qū)判讀規(guī)則（-7＜d≤2），以低于灰區(qū)的判讀規(guī)則為陰性，以高于灰區(qū)的判讀規(guī)則為陽性。結(jié)果顯示，擬定灰區(qū)和擴大擬定灰區(qū)判定陰、陽性結(jié)果的準確性為100%。列入擴大擬定灰區(qū)的樣本數(shù)比擬定灰區(qū)增加了19例（14.4%），以HLA-B7、HLA-B37及HLA-B27為主。見表2、表3。

表2 FCM試劑盒推薦判定值與擬定灰區(qū)及擴大擬定灰區(qū)判定效能的比較 例

表3 擬定灰區(qū)與擴大擬定灰區(qū)樣本的基因型分析例（%）

2.5 HLA-B27各型別d值的比較

采用FCM檢測基因型為HLA-B27的樣本，其HLA-B27抗原強度并不相同，但按基因分型進行比較，不同基因型別之間的d值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。攜帶的B27的個數(shù)不同，其熒光強度的d值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 HLA-B27不同基因型別d值的差異

3 討論

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性炎性脊椎關(guān)節(jié)病，主要累及骶髂關(guān)節(jié)及中軸關(guān)節(jié)，典型的臨床表現(xiàn)為炎性腰背痛，致殘率較高。由于早期發(fā)病隱匿，癥狀不特異，當確診時往往已錯過最佳治療時機[3]。有研究結(jié)果顯示，HLA-B27與AS密切相關(guān)，AS患者HLA-B27的陽性率＞94%，而正常人的陽性率＜10%，因此HLA-B27已成為臨床上AS的早期診斷和鑒別診斷的重要輔助指標[4-6]。在國際脊柱關(guān)節(jié)炎（spondyloarthritis，SpA）評價工作組2009年6月發(fā)布的標準中，再次強調(diào)了HLA-B27的重要性，相對于傳統(tǒng)的AS標準，SpA分類標準將診斷敏感性提升至82.9%，特異性為84.4%[7]。

HLA-B27是目前腰背痛患者的常規(guī)檢測項目，雖然FCM因操作簡單、檢測快速、敏感性高及特異性高等優(yōu)點而被各臨床實驗室廣泛用于檢測HLA-B27，但許多實驗室發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CM檢測AS患者的HLA-B27陽性率偏低，與國外文獻報道[8]有一定差距。除去影像學(xué)錯判導(dǎo)致臨床誤診為AS外，另一個主要原因可能是HLA-B27 FCM檢測結(jié)果的判讀臨界值不合適我國人群，從而導(dǎo)致陽性結(jié)果被錯判為陰性。本研究結(jié)果顯示，由于進口試劑盒設(shè)置的臨界值偏高，導(dǎo)致有44.4%的陰性樣本B27結(jié)果判定有誤，且灰區(qū)的設(shè)立對陰、陽性的判定幫助不大。

按照FCM試劑盒的使用說明書要求，所有低于試劑盒推薦臨界值的樣本判定為陰性，高于臨界值10的確定為陽性，高于臨界值0～10判定為灰區(qū)，推薦采用備用方案重新檢測[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)如果采用FCM試劑盒提供的陰、陽性判斷標準，雖然24例陽性樣本的Flow-rSSO法結(jié)果均為B27，45例灰區(qū)樣本也均為B27，但在63例陰性樣本中有28例（44.4%）Flow-rSSO法檢測結(jié)果為HLA-B27，此28例患者中有20例未能被明確診斷，有4例雖然FCM檢測HLA-B27的結(jié)果為陰性，但臨床依然作出了AS的診斷，僅有4例患者有其他與AS無關(guān)的明確診斷，與SpA分類標準中HLA-B27診斷AS的特異性（84.4%）相近。由此可見，準確的HLA-B27檢測結(jié)果有助于臨床的診斷，錯誤的結(jié)果往往會使臨床醫(yī)生對診斷產(chǎn)生疑惑。基因檢測可以說是HLA-B27判定的金標準。采用實時熒光定量PCR對HLA-B27位點進行擴增，可以得出陰、陽性的結(jié)論，但是會漏檢一些少見型別的B27，如果要囊括全部型別，則會使PCR檢測數(shù)明顯增多，工作量成倍增加[12-13]。Flow-rSSO法可對HLA-B位點進行分型，通過計算機進行大量的數(shù)據(jù)分析，將不確定度降低至1%，與實時熒光PCR相比，不但準確度有所提高，而且可以對B27陽性的樣本作更深入的分型確認，對非B27的樣本也能給出具體的型別鑒定結(jié)果，因此被不少研究中心作為HLA-B27基因分型的參考標準[14]。

Flow-rSSO法可以對HLA-B位點進行明確分型，但會導(dǎo)致常規(guī)HLA-B27檢測成本增加。因此，對FCM試劑盒推薦的陰、陽性判讀范圍進行調(diào)整，得到適合本地區(qū)患者的判定臨界值，采用分型的方法對灰區(qū)樣本進一步檢測，更為經(jīng)濟、高效。

本研究對132例樣本的FCM結(jié)果進行分析，并以Flow-rSSO法的分型結(jié)果作為參考標準，結(jié)果顯示，將灰區(qū)范圍定在-5＜d≤0時，假陰性與假陽性率都為0，灰區(qū)樣本HLA-B27的檢出率為86.06%。收集20例FCM檢測熒光強度分布在各區(qū)間的樣本，每份樣本檢測3次，進行重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示樣本d值的最大值與最小值的差值≤2。因此本研究擴大了擬定灰區(qū)的范圍，上、下界限各擴大2，將其定為-7＜d≤2，雖然灰區(qū)的樣本數(shù)增加了9.8%，B27的檢出率降至80.65%，但本研究認為這種判定方式可以更好地避免假陰性和假陽性。

本研究中臨床未明確診斷為AS，但有AS相關(guān)癥狀的患者共90例。依據(jù)FCM試劑盒推薦值判定為陽性的患者有19例；依據(jù)FCM試劑盒推薦值判定為灰區(qū)的，用擴大擬定灰區(qū)直接判定為陽性的有23例，其基因型均為B27；2種方法都判定為灰區(qū)而基因型為B27的有9例；依據(jù)FCM試劑盒推薦值判定為陰性而本研究判定為灰區(qū)，通過進一步檢測基因型為B27的有28例。這些相關(guān)癥狀包括但不僅限于腰痛、背痛、胸椎退行性變、骶髂關(guān)節(jié)炎、膝關(guān)節(jié)炎、膝關(guān)節(jié)退行性病變等。由此可見，準確的HLA-B27檢測結(jié)果對于臨床診斷有相當大的輔助作用。另外，有20例臨床患者初診為AS，其樣本依據(jù)FCM試劑盒推薦的陰陽性判讀標準，只有8例為陽性，按本實驗室自建擴大灰區(qū)標準判讀，新增5例灰區(qū)樣本，基因型檢測結(jié)果均為B27。

據(jù)文獻報道，目前已發(fā)現(xiàn)HLA-B27亞型160種，依次命名為HLA-B27：01至161（無HLA-B27：22），分別由213個等位基因編碼[15]。最常見的亞型為B2705、B2704及B2702，其中B2705是目前所知的所有亞型的原型，存在于所有種族中，而B2704在亞洲人群中為優(yōu)勢亞型[16-17]。本研究對樣本的HLA-B位點分型結(jié)果作進一步分析，結(jié)果顯示基因型為B27的樣本共97例，檢測到的型別有B2702、B2704、B2705、B2707、B2715，雜合子中最多的是B2704 [55例（56.70%）]，其次為B2705[34例（35.05%）]。通過分析不同基因型別的HLA-B27抗原的熒光強度，發(fā)現(xiàn)雜合子之間的d值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而2例B2704純合子的d值明顯高于雜合子（F=6.01，P＜0.01）。由此推測影響FCM檢測HLA-B27抗原強度的因素是位點個數(shù)而非種類。

本研究對在灰區(qū)范圍內(nèi)的樣本進行基因型分析，結(jié)果顯示，除HLA-B27外，還有HLA-B7和HLA-B37，這3個型別占灰區(qū)樣本的96.77%。HLA-B7和HLA-B37的影響均屬于交叉反應(yīng)，其中HLA-B7隸屬于交叉反應(yīng)組[18-19]，而HLA-B37則屬于非交叉反應(yīng)組抗原，且與HLA-B27有交叉反應(yīng)[20-23]。

FCM檢測HLA-B27抗原的熒光強度與樣本T細胞表面HLA-B27抗原表達量有關(guān)，去除基因型的因素后，推測這可能與人種差異有關(guān)。因此，進口試劑盒設(shè)定的臨界值是否適用于我國人群還有待研究，其臨界值設(shè)定過高，可能會漏診相當一部分AS患者。不合適的灰區(qū)范圍可能會造成過多的假陰性，過大的灰區(qū)范圍又會對導(dǎo)致檢測成本和工作量增加。因此，不同地域的實驗室在確定HLA-B27的臨界值時，可以以檢測試劑盒提供的數(shù)據(jù)為參考，建立合適而準確的灰區(qū)范圍判斷體系，以便在最合理的條件下提高檢測準確率。