NKX2-5在乳腺癌患者他莫昔芬耐藥中的作用及調控機制

趙 錚， 李 毅， 楊飛翔

（湖北醫藥學院附屬東風醫院檢驗科，湖北 十堰 442000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，每年發病率占女性惡性腫瘤的29%[1]。內分泌治療是雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌最有效的治療手段。有研究結果顯示，內分泌治療可降低ER陽性乳腺癌患者的復發和死亡風險，提高生存率[2]。內分泌治療藥物的耐藥會使乳腺癌治療難度增加。有調查結果顯示，約有25%的ER陽性乳腺癌患者對他莫昔芬（tamoxifen，TAM）初始治療無效，即使在首次TAM治療有效的患者中，也有40%最終可能會發展成獲得性耐藥[3]。因此，探討TAM的耐藥機制對乳腺癌臨床治療具有重要的指導意義。轉錄因子NKX2-5是NK同源盒-2基因的成員，主要表達于心臟組織，維持心臟的正常發育和功能[4]。近來年，有學者發現部分惡性腫瘤中NKX2-5表達異常，與腫瘤的發生、發展關系密切，如前列腺癌等實體瘤中NKX2-5表達下調，并與患者不良結局呈負相關[5]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路在乳腺癌內分泌治療藥物耐藥機制中扮演著重要角色。有研究結果顯示，阻斷MAPK信號通路可以抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，而激活該信號通路會增強ER轉錄效率并導致TAM耐藥[6]。本研究擬分析NKX2-5是否能通過阻斷MAPK信號通路逆轉TAM耐藥。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2012年7月—2016年7月在湖北醫藥學院附屬東風醫院采用規律內分泌藥物（TAM 20 mg/d）治療的乳腺癌患者50例，年齡23～73歲。收集所有患者TAM治療前切除的乳腺癌組織及對應的癌旁組織樣本。納入標準：病理檢查證實為乳腺癌，入院前未接受過放療、化療、激素治療或其他抗癌治療。排除合并其他惡性腫瘤者。50例患者中有18例（36.0%）發生TAM耐藥，再次收集TAM耐藥患者的組織樣本。組織樣本取出后立即置于液氮中保存。本研究經湖北醫藥學院附屬東風醫院醫學倫理委員會批準，所有患者治療前均簽署知情同意書。

1.2 數據庫分析

從高通量基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）下載乳腺癌患者基因表達數據（GSE42568），通過整理數據庫中的相關數據，分析患者總生存率、無復發生存率與腫瘤組織基因表達水平的關系。

1.3 細胞株來源

人乳腺癌細胞株MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3及正常乳腺細胞株MCF10A均購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。所有細胞均接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基（美國Thermo Fisher Scientific公司）中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養。按LI等[7]報道的方法構建TAM耐藥MCF-7細胞株（MCF-7/TAM）：將TAM溶于甲醇中，配置成終濃度為50 mg/mL的溶液，MCF-7細胞用含1 μmol/L TAM的RPMI-1640培養基培養，持續培養6個月。后續為了維持細胞對TAM的耐藥表型，將細胞培養于含0.5 μmol /L TAM的培養基中。

1.4 主要試劑

TAM（美國Sigma公司），NKX2-5抗體（武漢博士德生物工程公司），生物素標記的山羊抗小鼠IgM抗體（二抗）（北京博奧森生物技術有限公司），兔抗人細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、磷酸化細胞外調節蛋白激酶（phosphorylatedextracellular regulated protein kinase，p-ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated-p38 mitogenactivated protein kinase，p-p38MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化c-Jun氨基末商激酶（phosphorylatedc-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）。

1.5 癌組織和癌旁組織樣本中NKX2-5的表達

所有組織樣本均用中性甲醛固定，石蠟包埋后制成厚度為3 μm的切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。加入0.1%過氧化氫，室溫孵育15 min，消除內源性過氧化物酶，微波修復抗原，5%羊血清封閉10 min。滴加NKX2-5抗體，4 ℃孵育過夜，再滴加生物素標記的二抗，室溫孵育1 h。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，中性樹膠封固，CX41型光學顯微鏡（日本Olympus光學工業株式會社）下觀察。根據陽性細胞比例和染色強度，采用半定量評分法對免疫組化染色結果進行評價。染色強度：無染色記0分，輕度染色記1分，中度染色記2分，重度染色記3分。陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，陽性細胞百分比＜10%記1分，陽性細胞百分比為10%～50%記2分，陽性細胞百分比＞50%記3分。最終評分為染色強度得分×陽性細胞百分比得分。

1.6 NKX2-5過表達和抑制

NKX2-5過表達質粒（Ad-NKX2-5）、空載質粒（Ad-NC）及NKX2-5小干擾RNA質粒（NKX2-5-siRNA）、空白對照（NC-siRNA）由上海吉瑪生物制藥有限公司合成。NKX2-5-siRNA序列為：5'-GCAGCUUCACCUAUCCGAU-3'，NC-siRNA序列為3'-CGUCGAAGUGGAUAGGCUA-5'。采用瞬時轉染技術將Ad-NKX2-5、Ad-NC轉染MCF-7/TAM細胞（Ad-NKX2-5組、Ad-NC組），將NKX2-5-siRNA、NC-siRNA轉染MCF-7細胞（NKX2-5-siRNA組、NC-siRNA組）。采用Lipofectamine 2000脂質體瞬時轉染過表達質粒和低表達質粒，具體步驟：將細胞接種于6孔板，加入200 μL Lipofectamine 2000和4 μg質粒，室溫避光孵育20 min，37 ℃、5%CO2條件下培養6 h后更換培養基，繼續培養48 h后檢測轉染后的蛋白表達，驗證轉染效率。

1.7 細胞增殖活力的檢測

取處于對數生長期的細胞，用不含胎牛血清的培養液重懸，細胞計數為1.0×104個/mL。將細胞接種于96孔板（100 μL/孔），分別用5、20、50、100 μmol/L TAM處理，連續培養72 h，采用CCK-8試劑盒檢測培養24、48、72 h時各孔的吸光度（A）值，計算并繪制細胞在不同濃度TAM下的增殖抑制曲線，各組實驗平行重復3次，取平均值。增殖抑制率=（對照組A值-實驗組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。

1.8 乳腺癌細胞中各種蛋白的表達

收集Ad-NKX2-5組、Ad-NC組、NKX2-5-siRNA組和NC-siRNA組細胞，加入1 mL RIPA裂解液，冰浴上裂解20 min，4 ℃ 16 110×g離心15 min，吸取上清液，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白測定試劑盒檢測蛋白純度。取50 μg總蛋白，用10%十二磺基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離。分別加入NKX2-5抗體（1∶1 000）、ERK抗體（1∶1 000）、p-ERK抗體（1∶1 000）、P38抗體（1∶1 000）、p-P38抗體（1∶1 000）、JNK抗體（1∶1 000）、p-JNK抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。次日用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3遍，滴加二抗稀釋液（1∶4 000），37 ℃孵育2 h。加入增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）液顯色，采用LAS4000mini超靈敏化學發光成像儀拍照。以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.9 人乳腺癌細胞株MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3、MCF10A中NKX2-5 mRNA的表達及正常乳腺細胞株

采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3、MCF10A細胞中NKX2-5 mRNA的表達。采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，并用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒將0.5 μg總RNA逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA）。取1 μL cDNA產物進行聚合酶鏈反應（ploymerase chain reaction，PCR）擴增。NKX2-5：5'-CGGACCACCTCGCCTTACA-3'（正義鏈），5'-CTGGGCTCCTTCCCTCATCG-3'（反義鏈）；GAPDH：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'（正義鏈），5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'（反義鏈）。反應條件：95 ℃45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環。以GAPDH為內參，按2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.10 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗。繪制Kaplan-Meier生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織樣本中NKX2-5的表達

免疫組化染色結果顯示，NKX2-5主要表達于細胞質，陽性細胞顏色為棕黃色或褐色。癌旁組織NKX2-5的陽性表達率為74.0%（37/50），癌組織為42.0%（21/50），癌旁組織NKX2-5表達明顯高于癌組織（P＜0.05）。TAM敏感組織中NKX2-5表達明顯高于TAM耐藥組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同組織中NKX2-5的表達（×200）

表1 乳腺癌患者的一般資料

本研究50例乳腺癌患者和GEO數據庫104例乳腺癌患者的臨床資料見表1。

癌旁組織NKX2-5的評分明顯高于乳腺癌組織（P＜0.000 1）。TAM敏感組織NKX2-5的評分明顯高于TAM耐藥組織（P＜0.000 1）。見圖2。

NKX2-5高表達率為78.8%（82/104），NKX2-5低表達率為21.2%（22/104）。Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，NKX2-5低表達組總生存率和無復發生存率明顯低于NKX2-5高表達組（P＜0.000 1）。在接受TAM治療的乳腺癌患者中，NKX2-5低表達組總生存率明顯低于NKX2-5高表達組（P＜0.000 1）。見圖3。

圖2 不同組織免疫組化染色評分比較

圖3 NKX2-5高表達和低表達乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 人乳腺癌細胞株MCF-7、BCAP37、T47D、SKBR3及正常乳腺細胞株MCF10A中NKX2-5的表達

與MCF10A細胞相比，MCF-7細胞NKX2-5 mRNA和蛋白表達明顯升高，T47D、BCAP37、SKBR3細胞明顯降低（P＜0.05），見圖4。采用不同濃度TAM處理MCF-7、T47D、BCAP37及SKBR3細胞，結果顯示TAM對MCF-7細胞的半數抑制濃度（half inhibit concentration，IC50）低于T47D、BCAP37及SKBR3細胞，見表2。

由于MCF-7細胞NKX2-5的表達量相對較高，因此后續實驗均選擇MCF-7細胞作為研究對象。與MCF-7細胞比較，MCF-7/TAM細胞NKX2-5蛋白表達降低（P＜0.05），見圖5。

圖4 MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3及MCF10A細胞NKX2-5蛋白及NKX2-5 mRNA的表達

表2 不同濃度TAM對MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3細胞的增殖抑制率 %，x±s

圖5 MCF-7和MCF-7/TAM細胞NKX2-5蛋白表達的比較

TAM對MCF-7細胞的IC50低于MCF-7/TAM細胞，見表2。MCF-7和MCF-7/TAM細胞的NKX2-5蛋白表達均呈濃度依賴性降低，見圖6。

2.3 NKX2-5表達對TAM敏感性的影響

Ad-NKX2-5組NKX2-5蛋白表達明顯高于Ad-NC組（P＜0.05），NKX2-5-siRNA組蛋白NKX2-5蛋白表達明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05），見圖7。提示質粒轉染成功。

圖6 不同濃度TAM處理后MCF-7和MCF-7/TAM細胞NKX2-5蛋白表達的比較

采用50、100 μmol/L TAM處理后，Ad-NKX2-5組增殖抑制率明顯高于Ad-NC組（P＜0.05），NKX2-5-siRNA組增殖抑制率明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05）。見表3。

2.4 NKX2-5對MAPK信號通路的影響

MCF-7/TAM細胞p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表達明顯高于MCF-7細胞（P＜0.05），見圖8。

Ad-NKX2-5組p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表達明顯低于Ad-NC組（P＜0.05），NKX2-5-siRNA組p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表達明顯高于NC-siRNA組（P＜0.05）。見圖9。

圖7 Ad-NKX2-5組、Ad-NC組、NKX2-5-siRNA組和NC-siRNA組NKX2-5蛋白的表達

表3 不同濃度TAM對Ad-NKX2-5組、Ad-NC組和NKX2-5-siRNA組、NC-siRNA組的增殖抑制率%，

表3 不同濃度TAM對Ad-NKX2-5組、Ad-NC組和NKX2-5-siRNA組、NC-siRNA組的增殖抑制率%，

注：與Ad-NC組比較，*P＜0.05；與NC-siRNA組比較，#P＜0.05

images/BZ_59_197_1072_1117_1204.pngAd-NKX2-5組 8.7±0.521.4±5.7 56.9±10.1*67.9±7.8*Ad-NC組 4.3±0.419.7±4.5 28.9±7.3 49.7±7.1 NKX2-5-siRNA組19.8±5.438.9±6.2*#40.9±5.4*# 40.5±5.6*#NC-siRNA組 21.2±6.559.4±8.4 60.1±8.9 67.7±7.6

圖8 MCF-7細胞和MCF-7/TAM細胞MAPK信號通路相關蛋白的表達

圖9 Ad-NKX2-5組、Ad-NC組、NKX2-5-siRNA組和NC-siRNA組MAPK信號通路相關蛋白的表達

3 討論

內分泌治療藥物耐藥是ER陽性乳腺癌患者臨床治療的難點之一，耐藥的產生會影響內分泌治療的效果和患者的遠期生存率[8]。本研究分析了從GEO數據庫中獲取的相關數據，結果顯示NKX2-5低表達組總生存率和無復發生存率明顯低于NKX2-5高表達組，在接受內分泌藥物治療的乳腺癌患者中，NKX2-5低表達與總生存率有關，提示NKX2-5可能是乳腺癌的一種抑癌基因，或可作為乳腺癌預后評估的指標之一。同時，本研究臨床樣本的檢測結果顯示，乳腺癌組織NKX2-5表達降低，TAM耐藥患者的癌組織中NKX2-5表達也同樣降低，提示NKX2-5可能與乳腺癌TAM耐藥有關。

既往研究結果顯示，NKX2-5與心肌細胞的發育有關[9-10]。NKX2-5可激活α-肌動蛋白等心肌轉錄因子，在胚胎時期心肌組織定向分化過程中起關鍵作用[11]。近期有學者發現前列腺癌組織NKX2-5表達下調，NKX2-5可能通過表觀遺傳DNA甲基化改變抑制前列腺癌的早期病變[12]。還有研究結果顯示，肺癌血清NKX2-5水平明顯升高，NKX2-5高表達與患者的不良結局有關[13]。這說明NKX2-5表達可能存在組織特異性，在不同腫瘤中發揮的作用也不一樣。目前，尚未見NKX2-5與惡性腫瘤化療耐藥的相關報道。楊莉[14]的研究結果顯示，NKX2-5的同型家族成員NKX2-1與肺癌化療藥物的耐藥有關，NKX2-1高表達的肺癌細胞對吉西他濱的敏感性高于順鉑及多西他賽。本研究結果顯示，TAM對MCF-7細胞的IC50明顯低于MCF-7/TAM細胞，且MCF-7/TAM細胞NKX2-5蛋白表達明顯低于MCF-7細胞。提示NKX2-5可能參與了乳腺癌細胞TAM耐藥的發生。

本研究采用瞬時轉染技術上調MCF-7/TAM細胞和下調MCF-7細胞中NKX2-5的表達，結果顯示，上調MCF-7/TAM細胞NKX2-5表達可以明顯增強TAM對MCF-7細胞的抑制作用，而下調MCF-7細胞NKX2-5表達則可降低MCF-7細胞對TAM的敏感性。說明NKX2-5可以逆轉乳腺癌細胞對TAM的耐藥性。ALCáNTARA-ORTIGOZA等[15]分析了癌癥基因組數據庫，發現肺癌、乳腺癌等組織中缺乏NKX2-5；敲除NKX2-5基因后可激活SOX2和KRAS 2種癌基因，誘導組織出現惡性病變，并介導癌細胞逃避化療和藥物治療。LI等[16]的研究結果顯示，TAM可以上調NKX2-1表達，在TAM耐藥的細胞株中上調NKX2-1可以增加細胞對TAM的敏感性。本研究初步證實NKX2-5是一種抑癌因子，并可增加TAM耐藥乳腺癌細胞對TAM的敏感性。

內分泌治療藥物耐藥的產生是一個復雜的過程，有多種信號通路和調控機制參與其中。ERK、JNK和p38MAPK信號通路是生物體內存在的一條經典信號通路[17]。MAPK通路可將細胞外信號轉導至細胞核內，并引起細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學反應[18]。XU等[19]的研究結果顯示，阻斷MAPK信號通路可以抑制乳腺癌細胞增殖，激活此信號通路則可降低乳腺癌細胞對TAM的敏感性。既往研究證實TAM耐藥乳腺癌細胞中活化型ERK明顯增加，p-P38MAPK表達增加與MCF-7細胞TAM耐藥有關[20-21]。本研究結果顯示，與MCF-7細胞比較，MCF-7/TAM細胞p38MAPK、JNK、ERK的活化型蛋白（p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK）表達明顯增加，提示TAM耐藥細胞中MAPK信號通路處于激活狀態，TAM耐藥可能與MAPK信號通路活化有關。上調MCF-7/TAM細胞NKX2-5表達可以抑制MAPK通路，而下調MCF-7細胞NKX2-5表達則可激活MAPK通路，提示NKX2-5可能是通過抑制MAPK信號通路逆轉MCF-7細胞對TAM的耐藥。

綜上所述，TAM耐藥乳腺癌細胞中NKX2-5表達下調。上調NKX2-5表達或許能通過抑制MAPK信號通路逆轉MCF-7細胞對TAM的耐藥。NKX2-5有望成為TAM耐藥乳腺癌的潛在治療靶點。