DNA條形碼技術在動物類中藥鑒定中的應用研究進展

馮紅英

動物類中藥材具有療效突出、不良反應發生率低等特點，在我國中醫藥行業中占據重要地位。動物類中藥材大多來源于動物的不同組織或者器官，如：干燥全體、角、甲、殼、骨等，傳統性狀鑒定應用具有局限性。分子鑒定技術為動物類中藥材的鑒定提供了新的技術手段。DNA條形碼鑒定技術可以實現對物種進行快速鑒定，成功突破了傳統中藥鑒定技術對專業知識的要求。筆者對DNA條形碼技術在動物類中藥鑒定中的應用研究進展展開綜述，為保護珍稀藥用動物中藥資源提供理論依據。

1 DNA條形碼技術

DNA 條形碼的概念由加拿大動物學家Paul Hebert首次提出，是指使用一段較短的、標準的、易擴增的DNA片段對物種進行快速、準確、標準化的鑒定。DNA條形碼是以DNA序列為檢測對象，在物種個體發育過程中DNA序列不會改變，樣本受損也不會影響DNA識別結果；DNA條形碼技術是可以機械重復；DNA條形碼技術用于物種鑒別具有較高的準確性；還可以建立DNA條形碼數據庫，可以實現一次性快速鑒別物種樣本。DNA條形碼技術用于動物類中藥鑒定的主要技術流程為：采集樣品→處理樣品→提取DNA→設計、合成引物→提交結果至數據庫進行分析。主要分析方法有序列比對、系統樹構建、條形碼間距檢驗等。

2 DNA條形碼在動物類中藥鑒定的應用現狀

在動物類中藥材中，COI序列是公認的DNA條形碼標準序列，有研究者提出將ITS2序列作為動物類中藥材鑒定中的輔助序列。本文根據動物類中藥的藥用部位分類，總結與闡述DNA條形碼在動物類中藥鑒定的應用現狀。

2.1 肌肉類中藥材肌肉類中藥材指的是入藥部位為動物干燥全體、器官、肌肉纖維類中藥，此類中藥的DNA條形碼鑒定應用比較廣泛，如蜈蚣、全蝎、蛤蚧、水蛭等中藥材。蜈蚣具有息風止痙、攻毒散結、通絡止痛的功效，常與全蝎相須為用，蜈蚣、全蝎功效顯著，在藥材市場上摻偽品較多，在蜈蚣的傳統鑒別上，主要是根據蜈蚣的體型大小、背板顏色、步足等性狀特征[1]，鑒別準確度較低，DNA分子鑒定已經廣泛應用于蜈蚣的基原鑒定。張紅印等[2]采用DNA條形碼技術鑒定蜈蚣藥材，基于COI條形碼技術對蜈蚣藥材進行DNA提取，進行PCR擴增，雙向測序，使用MEGA6.0軟件進行序列比對、遺傳距離分析以及構建系統聚類數，結果發現使用COI序列條形碼可以準確鑒別蜈蚣藥材正品以及摻偽品，可以有效用于蜈蚣藥材的質量控制與監控。蛇類中藥材是中醫藥資源的寶庫，來源復雜,金錢白花蛇沒有毒性，在臨床上具有廣泛的應用[3]。廖婧等[4]通過分子鑒定技術構建華南地區20余種常用蛇類中藥材的DNA條形碼數據庫，主要用于蛇類中藥材的分子鑒定；該研究者還應用DNA條形碼技術快速鑒別金錢白花蛇及其偽品。張紅印等[5]利用COI序列作為條形碼序列，對蛤蚧中藥材以及摻偽品進行DNA提取，進行PCR擴增以及雙向測序，采用MEGA6.0對蛤蚧藥材所有11個物種的103份樣品進行序列比對，構建鄰接樹，基于COI序列構建的鄰接樹中蛤蚧正品單獨聚在一起，可與蛤蚧偽品進行準確區分，為保障蛤蚧中藥材的臨床用藥安全以及藥材市場監控提供有效方法。呂盼等[6]采用PCR技術，基于COI序列對水蛭科動物藥材水蛭、螞蟥、柳葉螞蟥以及各地方常用品種進行分子鑒定，構建水蛭的DNA條形碼分子鑒定方法。地龍具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功效，馬梅等[7]收集地龍藥材及其易混品種，提取DNA，得到COI和16SrRNA序列，經MEGA6.0軟件分析，構建地龍中藥材及其摻偽品的鄰接樹，結果發現地龍正品藥材以及混淆品種間COI和16SrRNA序列存在較多的變異位點，16SrRNA、COI序列可以準確區分地龍藥材及其摻偽品。

2.2 角骨類中藥材角骨類中藥材是指藥用部位為動物的角、骨、刺、甲等藥材的總稱，這類藥材的DNA含量較小，提取難度較大。鹿茸具有益氣強志、補血的功效，價格比較昂貴，在中藥材市場上摻偽品較多，目前DNA分子鑒定技術已經廣泛應用到鹿茸、鹿角類中藥材的鑒定[8]。劉冬等[9]對鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿筋、鹿尾、鹿胎分別進行DNA提取、COI序列擴增和序列測定，構建鹿類藥材COI序列數據庫，并對市售鹿類中藥材進行調查分析。DNA 條形碼技術可以作為鹿類中藥材的有效鑒定技術，并為市售鹿類中藥材的鑒定提供科學依據。王淼等[10]采用改良鹽析法從龜甲樣品中提取DNA，采用PCR技術鑒別中藥材龜甲真偽品，改法具有特異性高、鑒別簡單快捷、具有較強實用性的優點,在中藥材龜甲的真偽鑒別上具有較高的應用價值。崔麗娜等[11]研究龜甲及其摻偽品的原動物COI序列,采用MEGA 4.0軟件進行遺傳距離分析，并構建龜甲及其混淆品種的NJ樹，為龜甲中藥材的準確鑒定提供了有效的分子遺傳標記方法。穿山甲是我國的一種名貴中藥材，市場需求量較大，賈靜等[12]驗采用試劑盒法提取穿山甲及其混偽品的DNA，采用COI序列作為DNA條形碼對穿山甲及其摻偽品進行準確鑒定，為穿山甲的分子鑒定提供了科學依據。

2.3 其他類中藥材在貝殼類中藥材的鑒定上，使用DNA條形碼鑒定此類中藥材，多選取新鮮活體作為研究對象，進行DNA條形碼分類分析[13]。膠類中藥材多屬于貴重類中藥，由于炮制加工方法特殊，摻偽現象普遍存在，鑒別難度較大，DNA分子鑒定可以實現快速、準確鑒別膠類中藥材。阿膠是我國傳統的名貴中藥，被列為“補血圣藥”，阿膠是驢皮熬制的固體膠，價格昂貴，在中藥材市場上摻偽品較多，羅暉明等[14]采用PCR-RFLP法，以Cytb基因為目標基因，驢源性成分Cytb的PCR產物能夠被限制性內切Ⅰ酶切成76 bp和314bp 2個片段，而摻偽品的源性成分均不能夠被酶切，DNA條形碼技術可以準確鑒別阿膠原料驢源性成分。

3 小結

一些動物藥材，如骨骼類中藥材、分泌物等DNA含量較低，在應用DNA分子鑒定時，需要采取改良的DNA提取方法[15]。還有一些動物類中藥材，經過蒸煮、干燥等處理后，DNA降解比較嚴重，研究者開發出多種DNA條形碼序列[16]，可用于輔助區分COI序列無法準確鑒別的動物類中藥材。DNA條形碼數據庫是動物類中藥材分子鑒定的重要參考依據，但許多中藥材基源動物的DNA條形碼序列尚未被 Gen-Bank數據庫收錄[17]。今后應進一步拓展DNA條形碼技術在動物類中藥材中的研究范圍，針對特殊中藥材應開發出更加有效的檢測方法，完善基礎數據庫建設以及相關標準的制定，推動動物類中藥材分子鑒定和產業化的深入發展。