基于Cytb基因序列對牛肉制品摻假鑒定的研究進(jìn)展

田茂秀，余勤艷，李艷情，王紹平，陸龍波，李 麗

（銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

牛肉中含有豐富的氨基酸和Fe2+、Ga2+等離子，具有高蛋白，低脂肪，適宜對脂肪需求量比較少的人食用[1-3]。牛肉在中國的銷量僅次于豬肉。牛肉因其蛋白質(zhì)等成分更接近人類所需，故價格高于羊、豬、雞、鴨、等禽肉。由于利益的驅(qū)動，一些不良商家為了博取更多的經(jīng)濟(jì)利益，以廉價的肉制品代替牛肉。近年來，肉制品摻假事件層出不窮。如歐洲的馬肉事件[4]，沃爾瑪濟(jì)南泉城分店銷售的五香牛肉摻假狐貍和貉肉[5]，上海雞肉染色變牛肉事件。摻假的方法有以低價值的原料代替高價值的原料，從而減少原料上的成本，還有添加不法添加物掩蓋不良肉制品的現(xiàn)象。傳統(tǒng)的鑒定方法有感官評價法、三酰甘油光譜法、近紅外光譜法[6]、血清免疫鑒定法。上述方法雖然可以鑒定，但由于操作較復(fù)雜，對工作人員的專業(yè)水平要求較高，因此較少使用。而基于DNA 鑒定的方法準(zhǔn)確、高效、而成為研究的熱點(diǎn)。近年來，基于DNA鑒定的方法主要有熒光PCR法、多重PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法、DNA條形碼技術(shù)、重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)。本文主要基于牛Cytb基因的技術(shù)、原理、應(yīng)用來進(jìn)行綜述，希望能給肉制品鑒定提供一定的理論依據(jù)。

1 肉制品常見摻假方法

肉制品摻假分為來源欺騙、成分改變、加工過程和非肉質(zhì)成分的添加。來源欺騙，商家主要以牲畜的商標(biāo)、年齡、大小、質(zhì)量來欺騙顧客，如風(fēng)靡全國的注水豬肉事件、瘦肉精事件，成分代替是以低廉的肉制品冒充昂貴的肉制品，有的商家甚至用不可以食用的狐貍、馬肉、貓肉來冒充牛肉[7]。

2 基于DNA技術(shù)的肉制品摻假鑒定技術(shù)

2.1 環(huán)介導(dǎo)等鏈置換型DNA等溫擴(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等鏈置換型DNA等溫擴(kuò)增法（loopmediated isothermal amplification）是2000年研究出來的一種核酸恒溫擴(kuò)增方法。通過對目的基因的6個區(qū)域設(shè)計4條引物，在恒溫的條件下與鏈置換型DNA聚合酶在等溫（60～65℃）下1 h內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)109～1 010倍的擴(kuò)增，與一般的PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)操作較簡單，靈敏度較高，擴(kuò)增效率高，不依賴于專門的儀器與設(shè)備，檢測成本低。觀察結(jié)果方便，直接用視覺觀察有無白色沉淀和綠色熒光即可，無須進(jìn)行凝膠電泳成像。邵長春[8]等人通過對豬、牛、羊物種ND1、COXⅠ、cytb特異性基因分別設(shè)計引物，通過檢測熒光強(qiáng)度判斷反應(yīng)結(jié)果，通過循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，結(jié)果得出豬、牛檢測靈敏度為10 pg，牛的檢測靈敏度為1pg，結(jié)論為LAMP技術(shù)檢出限強(qiáng)、靈敏度高。

2.2 多重PCR法

多重PCR法是在同一個PCR擴(kuò)增體系中同時加入兩對或者兩對以上引物同時進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。其原理與普通PCR法相同，DNA在90℃高溫時發(fā)生解旋，當(dāng)溫度降到60℃左右時，引物與單鏈按照堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)溫度繼續(xù)降到72℃，即DNA聚合酶的最適溫度，在DNA聚合酶的作用下，新擴(kuò)增出來的子鏈與母鏈結(jié)合。多重PCR法具有高效性，能同時檢出多種肉制品，節(jié)約時間與試劑，減少經(jīng)費(fèi)的開支。李盈諾[9]等人成功地用特異性多重PCR檢測出3種肉。何瑋玲[10]等人建立了一種快速用于食品中4種肉類鑒別的通用引物PCR法，結(jié)果表明，該法可用于食品中多種動物源性成分的檢測。

2.3 熒光PCR法

熒光PCR法的檢測方法有DNA結(jié)合染料、水解探針（TaqMan）、分子信標(biāo)、熒光標(biāo)記引物和雜交探針，最常用的有SYBRGreenl法與TaqMan探針法。SYBGreenl法是在PCR體系中加入熒光染料，熒光染料特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，發(fā)出熒光，實(shí)行在線跟蹤DNA的過程的一種方法。與熒光染料特異性結(jié)合的，熒光染料則發(fā)出很強(qiáng)的熒光，未結(jié)合的則沒有通過。通過軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過軟件所得出的圖對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。TaqMan法則是利用TaqMan探針5'末端攜帶熒光基團(tuán)，3'攜帶淬滅基團(tuán)，PCR擴(kuò)增時，同時加入一對引物和特異性的熒光探針，報告基團(tuán)的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，Taq的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光檢測系統(tǒng)便能夠檢測到熒光信號，每增加一個熒光信號分子，則擴(kuò)增了一條DNA鏈。胡蓮霞[11]等人將4種肉粉中分別混入2～3種肉粉，應(yīng)用GNM C7—8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)和AB17500熒光PCR方法對以上摻假的肉制品進(jìn)行檢測和比對，結(jié)果顯示GNM C7—8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)能單獨(dú)對多種肉制品進(jìn)行檢測。

2.4 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼是指在生物體內(nèi)能夠代表物種的，有足夠變異能力的，短的易擴(kuò)增的DNA 片段，高玉時[12]等人以線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ為DNA條形碼對不同品種的雞進(jìn)行鑒定。王潔[13]以線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I基因標(biāo)記物種，對3個地方不同的鴨進(jìn)行檢測。

3 討論

環(huán)介等鏈置換DNA等溫擴(kuò)增法、多重PCR法、熒光PCR法、DNA條形碼技術(shù) 4種技術(shù)常常被用在肉制品的摻假鑒定中，但各自均有局限。環(huán)介等鏈置換DNA等溫擴(kuò)增法靈敏度高，擴(kuò)增速率快，且擴(kuò)增的過程中不需要特殊儀器，操作簡單，但是靈敏度高，開蓋容易形成氣溶膠污染，假陽性嚴(yán)重，引物的設(shè)計要求也比較高。多重PCR法經(jīng)濟(jì)、節(jié)約、快速，但是需多次摸索反應(yīng)的條件，且非特異性擴(kuò)增容易出現(xiàn)假陽性。熒光PCR技術(shù)無須電泳、測序等復(fù)雜的操作，不僅節(jié)約時間而且節(jié)約精力，擴(kuò)增速度快，靈敏度高。DNA條形碼技術(shù)準(zhǔn)確性高、建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可同時并快速鑒定大量樣本，進(jìn)行非專家物種鑒定。