神經干細胞在脊髓損傷修復機制中的實驗研究進展

岳倩文 綜述 夏鉑 審校

(寧夏醫科大學中醫學院，寧夏 銀川 750004)

脊髓損傷嚴重損害患者的脊髓結構及功能，引起其運動、感覺以及自主神經功能障礙或喪失，臨床上治療難度較大，且預后不良[1]。脊髓損傷后神經修復的作用機制目前尚不明確，當前研究熱點主要集中在脊髓損傷后神經干細胞的移植及其替代治療上，鑒于此作者從神經干細胞入手，探討脊髓損傷神經修復領域的實驗研究現狀。

1 神經干細胞

神經干細胞主要位于側腦室下區(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下區 (SGZ)[2]。研究[3]發現神經干細胞具有自我復制和多向分化潛能，并總結出神經干細胞(NSCs)是中樞神經系統內處于未分化狀態能夠自我更新復制，分化為神經元細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞的能力，能自我更新，通過不對稱分裂產生除自身以外的其他細胞，并足以提供大量腦組織細胞的干細胞。通常所說的神經干細胞是中樞神經系統中的干細胞，按照部位分類分為中樞神經干細胞(CNS-SC)和外周神經干細胞(PNSC)又稱神經嵴干細胞(NCSC)。根據細胞來源神經干細胞可分為：胚胎干細胞(ESC)、成體神經干細胞(ASC)、胚體神經干細胞(FSC)。

ASC可從自身獲得是最適合的供體，但因分化能力有使得ASC的應用范圍受到限制。人的脊髓內存在神經干細胞，在脊髓損傷后患者會出現遺留截癱，排便障礙、感覺障礙等后遺癥。神經干細胞在研究神經發育及中樞神經系統移植和替代治療起著重要作用，中樞神經系統的干細胞具有再生成神經元和膠質細胞的潛能，但神經干細胞的分裂、增生活動需要能量支持，按照調節因素可分為內源性和外源性[4]。

1.1內源性神經干細胞 內源性神經干細胞可以避免不良的免疫反應，避免了移植細胞階段存在的倫理道德問題。當實驗采用輕度脊髓損傷的大鼠模型探索脊髓損傷后神經干細胞增殖分化情況時發現脊髓損傷后大鼠脊髓背側出現出血灶，病灶周圍星狀細胞的樹突變厚和變寬并逐步形成膠質瘢痕。經DAPI染色后位于中央管的內源性神經干細胞會出現增殖，脊髓中央管內源性神經干細胞在輕度脊髓損傷后分化為神經元和星形膠質細胞，提示大鼠中的輕度脊髓損傷足以誘導內源性神經干細胞增殖和分化[5]。研究[6]表明，內源性神經干細胞廣泛增殖以應對脊髓損傷情況。脊髓損傷發生后首先破壞血管系統，造成缺氧，但缺氧有利于膠質細胞擴張，隨后細胞因子和生長因子的分泌，激活內源性神經干細胞，促進增殖[7]。

1.2外源性神經干細胞 Y.Zhao[8]發現支架的植入增加了神經元分化，減少了星形膠質細胞的分化，阻止了髓鞘對神經元分化的抑制，從而促進神經元傳遞及運動功能的恢復。但外源性神經干細胞的脆弱性，無法增殖分化為神經元的局限性，決定了其不能成為神經干細胞移植的理想細胞來源。在嚴重的脊髓損傷中，僅有小部分外源性神經干細胞分化為神經元而大多數分化為星形膠質細胞[9]。

2 神經干細胞與脊髓損傷修復

對于神經干細胞來說，細胞因子及其所在微環境是影響神經干細胞增殖、分化的因素，神經營養因子缺乏會導致脊髓再生障礙，而神經干細胞能否再生為新的神經元或軸突能否再生很大程度上取決于其中樞神經系統所在的微環境。通過中和表皮生長因子受體來改變這種不利的微環境信號傳導可能在損傷部位誘導出更多的神經元，加速脊髓功能恢復。X.Li[6]將植入西妥昔單抗修飾的線性有序膠原支架(locs)進入犬脊髓損傷部位，西妥昔單抗作為一種表皮生長因子受體信號的拮抗劑，在增殖的神經干細胞中表皮生長因子受體信號被大量激活并產生新的神經元。

2.1神經干細胞的微環境 神經干細胞的微環境主要包括:神經干細胞相鄰的支持細胞、細胞因子、細胞外基質和微血管網。脊髓損傷后微環境遭到破壞會相繼出現炎癥反應、微循環障礙、軸突斷裂、細胞凋亡等過程[10]。脊髓神經干細胞從靜止到增殖的轉變與脊髓損傷后微環境的變化有關。脊髓損傷所形成的炎性微環境會使其向星形膠質細胞分化而限制其向神經元分化。脊髓損傷后產生IL-1、IL-6等神經毒性物質[11]，使得神經干細胞死亡或分化為星形膠質細胞，形成抑制軸突再生的不利微環境，可能是影響脊髓損傷后神經修復的關鍵因素。在嚴重的脊髓損傷發生后，其缺乏所必需的神經營養因子及不利于神經修復的微環境，使神經網絡中只有一小部分神經干細胞衍生的神經元能夠存活并分化成脊髓損傷移植部位的神經元[6]。

神經干細胞除了分化為神經元細胞還分化成星形膠質細胞，星形膠質細胞后期會形成致密的膠質瘢痕，對損傷突起再生有機械性阻礙作用。Y.Liu[12]發現位于中央管的內源性神經干細胞在脊髓損傷后具有分化為星形細胞而非神經元的趨勢。但有研究[13]發現神經膠質瘢痕并非一無是處，其可能支持中樞神經系統軸突再生。王珊等[14]認為哺乳動物的中樞神經系統損傷后，所形成致密的瘢痕組織會封鎖傷口從而保護神經系統免受進一步破壞，這提示神經干細胞可以起到保護受損脊髓的作用。M.Stenudd[15]證明脊髓損傷后神經干細胞衍生的瘢痕成分可以限制脊髓損傷后的組織損傷和神經損失，該發現將內源性神經干細胞鑒定為治療脊髓損傷的潛在治療靶標。故星形膠質細胞在神經元存活、神經突觸形成及神經元反饋調節中起到關鍵作用[3]。

2.2神經營養因子/生長因子 脊髓損傷后神經營養因子/生長因子可以保護受損神經元，使損傷的細胞得到修復。神經干細胞可以分泌多種神經營養因子，如睫狀神經營養因子(CNTF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養素-3(NT-3)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、血管內皮生長因子(VEGF)等。

BDNF是一種光譜的神經營養因子，可刺激誘導軸突再生抑制神經細胞凋亡。宋昭君[16]采用載BDNF基因的陽離子超聲微泡(BDNF/CNBs)聯合超聲靶向破裂技術(UTMD)治療大鼠脊髓損傷，使大鼠神經功能的恢復。NT-3可以促進少突膠質細胞的增殖及再生軸突的髓鞘化，促進神經元的分化、生長、存活。VEGF是一種多功能生長因子，參與神經系統中軸突的生長及成熟的過程[17]。從幼鼠的脊髓組織中分離出細胞，在懸浮液中以不同濃度的VEGF的培養，發現20 ng/mL VEGF誘導增長最快，然后EdU標記來評估神經球中的細胞增殖，細胞周期蛋白D1顯著升高，VEGF可以在體外促進脊髓神經干細胞的增殖[18]。脊髓損傷后所形成的缺氧條件及細胞因子和生長因子的分泌有助于神經干細胞的增殖。與正常神經干細胞移植組相比，移植了VNSC的大鼠的運動神經元密度高45%，增加神經營養因子的釋放并降低TRPV1的表達，阻斷TRPV1受體可以減輕疼痛。VEGF-NSC轉基因移植導致增強的神經元和運動功能的修復。VEGF誘導的神經干細胞恢復脊髓損傷后神經元的損失，促進神經營養因子的釋放[19]。

神經干細胞對不同種類、不同濃度的因子及多種因子的聯合應用的作用不近相同。F.Liu等[20]實驗表明NGF 、BDNF是維持和分化發育神經元的關鍵，其中NGF在一定條件下可誘導軸突生長，對交感神經和感覺神經元的存活和維持至關重要。與單獨的BDNF或NGF作用相比，聯合BDNF和NGF治療誘導更多神經元。I.U.Khan[21]將BDNF和血紅素氧合酶-1(HO-1)表達的間充質干細胞(MSCs)注射到脊髓損傷的犬上，聯合治療組顯示犬的后肢功能顯著改善，炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子-α，白細胞介素-6，環氧合酶-2的表達減少以及星形膠質細胞減少，脊髓損傷犬的鞘內注射HO-1-MSCs后功能恢復得到改善。相較于HO1-MSCs或BNDF-MSCs組的治療， HO-1和BNDF-MSCs的共同移植治療更能有效的促進脊髓損傷后神經的修復。脊髓損傷后外源性NGF雖然具有神經再生修復作用,但對損傷局部再生也存在著抑制作用。

由此可見，不同的神經營養因子聯合作用更能改善細胞外環境，促進感覺和運動神經元軸突生長，抑制神經元凋亡的作用。

2.3神經干細胞的治療的實驗研究 神經干細胞移植不僅能取代損傷壞死神經元，實現軸突的髓鞘再生或分泌神經營養因子，還可以改善損傷區域的微環境，抑制炎性反應及瘢痕組織形成，起到保護神經元的作用[22]。含有神經干細胞和各種生長因子的纖維蛋白基質的移植顯著增強了脊髓損傷模型中的移植物存活率，并且移植物衍生的神經元因此獲得了長距離軸突生長并部分恢復了破壞的神經回路，增強神經營養因子分泌，抗氧化，抗炎和抗凋亡，促進神經再生[23]。

神經干細胞移植替代壞死神經元成為實驗研究治療脊髓損傷的方法之一。K.Z.Lee[24]在研究證實嚙齒動物移植的神經干細胞的神經元分化可使神經干細胞部分恢復。有研究[25]將脊髓損傷小鼠的神經干細胞移植到受損脊髓中，隨后進行中性粒細胞和巨噬細胞的免疫熒光染色和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞介素-1β(IL-1β)，白細胞介素-6(IL-6)的mRNA水平檢測，發現NSC移植可通過減少M1巨噬細胞活化和浸潤中性粒細胞來調節脊髓損傷誘導的炎癥反應并增強脊髓損傷后的神經功能。臨床上可用于緩解繼發性脊髓損傷的米諾環素長期服用存在毒性，X.J.Wang[26]開發的基于聚唾液酸(PSA)的米諾環素負載納米藥物輸送系統(PSM)在脊髓損傷的大鼠上進行實驗，發現可改善大鼠的運動功能，減少神經膠質瘢痕的形成，從而促進神經元的再生和長軸突在整個神經膠質瘢痕中延伸，保護神經元和髓鞘免受損傷。

以生物工程材料為代表的神經支架可以填補缺陷并重現細胞外基質的復雜結構成為替代材料首選。膠原支架具有良好的生物相容性和生物降解性，B.Fan等[27]將支架植入脊髓損傷大鼠病變區發現其可以減少疤痕沉積，促進神經生成，促進大鼠運動恢復。使用iPSC-NP治療急性脊髓損傷對脊髓再生中涉及的大多數研究因素產生了積極的影響，如神經膠質瘢痕形成，軸突發芽，組織保留和細胞因子水平。將iPSC-NP-LHM細胞—聚合物構建體植入慢性脊髓損傷導致材料整合到受損脊髓中，影響橋接腔中內源組織元素的浸潤，而且還增加受損區域以及周圍宿主組織中TH+軸突的萌發。iPSC-NPs在支架中存活，影響了內源TH+神經元的數量與星形膠質細胞緊密連通[28]。在細胞替代的探索中，N.Chen[29]將亮氨酸重復序列和免疫球蛋白結構域的蛋白LINGO-1RNA移植到脊髓損傷大鼠模型上，結果發現LINGO-1 RNA處理的大鼠神經干細胞移植增加。

盡管神經干細胞移植對脊髓損傷治療有很大的希望，但為了在功能上重建受損的神經回路，有必要將細胞替代療法與其他治療策略(雞尾酒療法)相結合。軸突再生是脊髓損傷修復的前提，有研究[30]將表達綠色熒光蛋白的神經干細胞包埋于含生長因子雞尾酒的纖維蛋白基質中，移植至脊髓損傷部位，發現其可以延伸出大量軸突。用纖維蛋白改變病變微環境后嵌入生長因子雞尾酒的矩陣觀察到移植的神經干細胞分化成多種類型的神經元，最終可促進嚴重脊髓損傷大鼠的運動功能改善。

3 小 結

脊髓損傷可導致軸突斷裂和神經元死亡，造成患者的永久性功能障礙。盡管神經干細胞的移植、替代及生物支架在脊髓損傷修復領域的實驗研究方面取得了重要進展，促進了損傷后微環境的改善及神經因子的修復，神經功能的恢復[31]，但是在脊髓損傷后神經元的功能不可能完全恢復是既定事實。(1)神經干細胞治療脊髓損傷存在兩大難點：①在抑制瘢痕組織形成的同時誘導促進神經元生長；②預防神經干細胞出現繼發性死亡[32]。當前人們在神經干細胞領域探索大多圍繞細胞移植及替代治療，在脊髓損傷領域除了神經干細胞的實驗研究，通過脊髓刺激(SCS)弱施加的DC電場，也可促進神經突雙向再生。盡管許多新型治療方法在脊髓損傷實驗的動物模型中顯示出前景，但這些實驗所模仿的脊髓損傷與患者的實際情況仍存在差距。(2)目前在脊髓損傷領域所探討的神經干細胞大都是中樞神經系統，而有研究[33]報道指出中樞神經系統不具備與周圍神經系統相同的再生能力，中樞神經系統功能會隨著年齡的增長而降低。長期受傷的神經組織環境對神經干細胞的存活，生長和分化是一個巨大的挑戰。在體外用細胞穩定填充的支架不一定用作體內不利環境的理想細胞載體。盡管在脊髓損傷修復領域的最新進展已經表明，中樞神經系統具有更多的固有再生能力但中樞神經系統是否具備與周圍神經系統的再生能力仍待進一步研究證實。(3)體外生長并不能反映體內情況，J.Ruzicka[28]將IPS衍生是神經干細胞接種于LHM水凝膠上，在整個研究期間，LHM水凝膠支持材料中細胞可以粘附生長，然而細胞仍然不成熟。說明支架應用于脊髓損傷的修復領域仍需要更多的探索。雖然支架的整合和移植細胞的神經分化不能導致功能恢復，但它可以改變慢性脊髓損傷的微環境并可能使重要的生理功能恢復。(4)在開發細胞移植療法治療脊髓損傷時安全性是進一步的重要考慮因素，另外需要解決其取材及體外培養的難題。

總之，神經干細胞應用于脊髓損傷的神經修復是人類治療脊髓損傷的希望，雖然神經干細胞的作用機制已經明確，但當其應用于脊髓損傷領域尚存在許多問題急需研究解決。