SMPD1基因與細胞外囊泡生物發生的研究進展

黃子慧?陳煜森?馬曉瑭?許小冰?李嬋娣

【摘要】由SMPD1基因編碼的酸性鞘磷脂酶不僅介導溶酶體代謝、參與膜結構的調節和信號轉導，且對鞘磷脂轉化為神經酰胺起關鍵作用。細胞外囊泡是由細胞分泌或細胞膜上脫落的一種具有多功能的異質膜囊泡。研究顯示，酸性鞘磷脂酶及其下游代謝物神經酰胺與細胞外囊泡的分泌釋放相關。如今細胞外囊泡的生物發生越來越受到人們的關注，該文就SMPD1基因對細胞外囊泡生物發生的研究現狀進行綜述。

【關鍵詞】SMPD1基因;酸性鞘磷脂酶;神經酰胺;細胞外囊泡

Research progress on SMPD1 gene and extracellular vesicle biogenesis Huang Zihui， Chen Yusen， Ma Xiaotang， Xu Xiaobing， Li Chandi. Department of Neurology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

Correspondent author， Chen Yusen， E-mail： chenyusen925@ 163. com

【Abstract】Acid sphingomyelinase encoded by SMPD1 gene not only mediates lysosomal metabolism， participates in membrane structure regulation and signal transduction， but also plays a key role in the conversion of sphingomyelin into ceramide. Extracellular vesicles are multifunctional vesicular vesicles that are secreted by cells or shed on the cell membrane. Studies have shown that acid sphingomyelinase and its downstream metabolite ceramide are associated with the secretion and release of extracellular vesicles. Nowadays， the bioecogenesis of extracellular vesicles has attracted more and more attention. This article reviews the research status of SMPD1 gene on extracellular vesicle biogenesis.

【Key words】SMPD1 gene;Acid sphingomyelinase;Ceramide;Extracellular vesicle

細胞外囊泡（EV）可包裹生物活性蛋白、糖類、脂質和廣泛核酸，作為獨特載體在體液中穩定存在，起細胞間通訊、生物標志物、治療等作用[1]。越來越多研究表明EV在多種疾病的預防、診斷、治療、預后評估中具有良好的應用前景。因此，明確EV生物發生的作用和分子機制對疾病的預防和治療都有著重要意義。關于EV的命名和分類尚未統一，? 一般認為其包括外泌體、微囊泡（也稱為微粒）、外胚層、遷移體和凋亡小體。本文主要討論2種被廣泛研究的EV，即外泌體和微囊泡。SMPD1基因介導編碼的酸性鞘磷脂酶（ASMase）及其下游代謝物神經酰胺可通過改變脂質成分使細胞膜特性劇烈變化而觸發信號傳導事件并改變膜曲率，參與EV的分泌與釋放。研究SMPD1基因編碼的ASMase有望通過調控EV生物發生為疾病尋找到新的治療靶點。

一、SMPD1基因概述

1. SMPD1基因及其所編碼的蛋白

SMPD1基因的細胞遺傳學位置在11號染色體的短臂（11p15.1 ～ 11p15.4），其模板DNA全長約 2.5 kb，包括 1890 bp 的開放閱讀框，編碼 629 個氨基酸。其編碼酶的6個N-糖基化位點中有5個被占據，寡糖側鏈含有甘露糖-6-磷酸殘基，這是溶酶體蛋白的典型特征。此外對ASMase二硫鍵結構的研究顯示，氨基酸殘基629處的末端半胱氨酸是唯一不參與分子內二硫鍵的半胱氨酸。事實上，這一末端半胱氨酸殘基必須去除才能獲得完整的ASMase活性，因此該殘基在成熟蛋白質中的保留可能會導致出現不具活性、分子量較高的聚集物[2]。

2. ASMase

SMPD1基因編碼的ASMase屬于鞘磷脂酶家族，可在多種細胞內表達。ASMase在細胞信號傳導中的作用與其重組質膜的能力緊密相關。ASMase對鞘磷脂轉化為神經酰胺起關鍵作用，前者在一定外源刺激下能快速被活化并釋放到細胞表面，水解細胞膜上鞘磷脂，使神經酰胺水平在數秒至數分鐘內迅速上升。富含神經酰胺的結構域進一步融合，于細胞質膜外小葉上形成神經酰胺大平臺，以增強蛋白質密度，并通過改變膜物理性質或直接的神經酰胺-蛋白質相互作用，促進受體二聚化以及其他蛋白質-蛋白質相互作用。目前認為，ASMase有助于重組細胞表面并激活微域內的信號蛋白，從而增強或降低下游信號的閾值。另神經酰胺可進一步轉化為鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、鞘氨醇等一系列生物活性脂質，通過脂質成分的改變促進細胞膜特性劇烈變化而觸發信號傳導事件[3]。神經酰胺和S1P作為信號分子中的主要鞘脂控制許多細胞活動，包括血管生成、炎癥、細胞增殖、凋亡、衰老、自噬、轉移等。ASMase不僅介導了溶酶體代謝、參與膜結構的調節和信號轉導，還參與免疫調節、炎癥、細菌感染、凋亡、腫瘤調控、脫髓鞘等過程[4-7]。可見，SMPD1基因編碼的ASMase對細胞和組織的正常結構及功能至關重要。

3. SMPD1基因與疾病

SMPD1基因缺失會引起尼曼-皮克病（NPD），NPD是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，屬于溶酶體貯積癥[8]。ASMase缺乏可表現出A型或B型NPD。A型NPD患兒通常伴隨著神經系統癥狀，并在出生6個月內逐漸出現肝脾腫大、生長受限和明顯的肺部感染等。B型NPD患者很少或不出現神經變性，其最常見的臨床表現是肝脾增大，一般能存活到成年，發病年齡可從幼兒期到成年期。

除NPD外，ASMase活性的改變還與多種神經系統疾病息息相關。研究者在病例對照分析研究中發現，SMPD1基因中的Leu-Ala（Val）重復變異增加了中國漢族人群帕金森病的患病風險[9]。SMPD1基因敲除或敲減可使HeLa細胞中α-突觸核蛋白水平增加，而帕金森病患者中SMPD1突變，ASMase水平降低，使帕金森病發生提早3.5 ～ 5.8年[10]。在阿爾茲海默病（AD）中，AD患者和AD小鼠的成纖維細胞、腦或血漿中ASMase增加，導致自噬空泡數量增加，從而引起自噬降解缺陷。在AD小鼠模型中，抑制ASMase可減少β淀粉樣蛋白沉積并挽救受損記憶[11]。在創傷性腦損傷中，ASMase的轉錄后激活可導致損傷后第1周線粒體中鞘氨醇選擇性增加，伴隨線粒體細胞色素氧化酶活性降低和Nod樣受體蛋白3炎癥小體活化，使線粒體呼吸鏈紊亂及促進神經炎癥。抑制ASMase還可以減輕創傷性腦損傷早期反應性星形膠質細胞病變[12]。研究表明，ASMase在老年人和老年小鼠的腦微血管內皮細胞和血漿中升高，其通過增加細胞膜穴樣內陷介導的胞吞作用導致血腦屏障損傷和加速神經元功能障礙。ASMase的基因敲減和內皮特異性敲減可改善血腦屏障破壞和衰老期間的神經認知障礙[13]。

二、EV的生成與分泌機制

外泌體是先在多泡體內形成管腔內囊泡（ILV）然后與質膜融合而分泌形成的，代表粒徑40 ～ 100 nm的囊泡群。外泌體在多泡體中形成ILV，需要招募轉運必需內體分選復合物（ESCRT）到ILV形成部位[14]。在多泡體中產

生ILV的分子基礎是ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等4種蛋白組成的復合體和輔助蛋白ALIX（也稱為PDCD6IP）。ESCRT 0識別內體膜外部的泛素化蛋白質。ESCRTⅠ將泛素化的內容物結合在內體膜上，激活ESCRTⅡ。ESCRT Ⅲ通過ALIX募集，并與ESCRT-Ⅰ復合物上的TSG101結合。ALIX與TSG101結合，起到連接ESCRT I和ESCRT Ⅲ的作用。隨后，募集去泛素化酶，從內容物蛋白中去除泛素標簽以完成分選過程。最后，ESCRT Ⅲ被AAA-ATPase SKD1分解并回收利用以進行另一輪內容物招募。總之，ESCRTⅠ和Ⅱ被認為是啟動ILV萌芽的過程，而ESCRT Ⅲ則完成了這一過程。然而并非所有外泌體的形成都是依賴ESCRT途徑的，一些細胞在ESCRT復合物敲除的情況下仍然能產生外泌體。

微囊泡是粒徑大小為100 nm ～ 1 mm、由質膜衍生的比外泌體更大的異質囊泡群。其直接由質膜發芽起泡釋放而成，并可能包含細胞骨架和內質網元件，涉及皮質肌動蛋白重組和隨后的質膜向外突出和分離。鈣離子依賴性酶機制包括氨基磷脂轉位酶、拼接酶和鈣蛋白酶驅動膜磷脂不對稱重排，即磷脂酰絲氨酸從內小葉到細胞表面的暴露，導致膜的物理性彎曲和肌動蛋白細胞骨架重組，這有利于膜出芽和微囊泡形成[15]。

細胞如何分泌與釋放EV尚處于初級研究階段，有研究表明這些過程需要細胞骨架蛋白如微絲及微管蛋白、動力蛋白、小鳥苷三磷酸（GTP）酶以及融合可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白附著蛋白（SNARE）和錨定蛋白的參與。亦有研究表明某些膜脂在調節EV分泌中起作用，如由二酰甘油激酶或磷脂酶D活性而產生的磷脂酸可影響外泌體分泌。

三、ASMase與EV

1. ASMase與EV

ASMase與病理條件下紅細胞釋放EV相關。據報道，鐮狀細胞病的質膜應激和改變，增強了ASMase的活性，導致紅細胞產生的EV增加[16]。使用ASMase間接抑制劑阿米替林治療可減少鐮狀細胞病的體外和體內模型中EV的產生，這提示了減輕病情的可能治療方法。另一項研究表明，ASMase與內皮細胞中香煙煙霧誘發的EV釋放有關[17]。暴露于香煙煙霧后，內皮細胞自身收縮并從縮回絲狀偽足結構的尖端釋放EV。使用ASMase抑制劑丙咪嗪可明顯降低香煙煙霧誘導的EV產生，暴露于香煙煙霧后缺乏ASMase小鼠血漿中EV水平降低，而在內皮細胞過表達ASMase小鼠中循環EV水平增加，這些結果均證實了ASMase的激活在香煙煙霧誘導的EV釋放中起關鍵作用。

2. ASMase與外泌體

有研究表明，神經酰胺合成參與多泡體腔內囊泡的形成不依賴ESCRT生物發生途徑，多泡體與質膜融合后，囊泡以外泌體的形式釋放。然而可使鞘脂酶水解成磷酸膽堿和神經酰胺的除了ASMases外，還包括了其他鞘磷脂酶，其中對外泌體生物發生研究較多的是中性鞘磷脂酶（NSMase）。在少突膠質細胞系（Oli-Neu）外泌體的分選機制研究中，用NSMase抑制劑處理Oli-Neu細胞后，外泌體釋放明顯減少。NSMase2的小干擾RNA耗盡也證實了酶參與包裹蛋白脂質蛋白（PLP）外泌體的形成和分泌。在此基礎上，有學者提出PLP陽性外泌體的生物發生在富含鞘磷脂的膜結構域，它們通過形成神經酰胺微結構域進而聚結成更大的結構域，促進囊泡出芽。神經酰胺的錐形結構誘導內體膜的自發負曲率，有利于多泡體內部形成內囊泡。隨后的研究顯示，給予外源性神經酰胺可劑量依賴性地增加從多發性骨髓瘤細胞中釋放的外泌體數量[18]。鞘磷脂合酶抑制劑D609抑制神經酰胺轉化為鞘磷脂引起神經酰胺升高促進了外泌體分泌[19]。總而言之，神經酰胺對外泌體釋放十分重要。

在人巨噬細胞系U937中，ASMase通過氧化LDL的免疫復合物對表面Fcγ受體的作用而激活，使含有IL-1β的外泌體釋放[20]。ASMase與外泌體釋放的研究目前報道較少。但既然ASMase也可作用于鞘磷脂生成神經酰胺，那么其對外泌體釋放可能也具有重要調控作用，值得進一步研究。

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（收稿日期：2019-11-01）

（本文編輯：林燕薇）