結合惡性胸腔積液中脫落細胞探討上皮細胞-間質轉化與非小細胞肺癌的相關性

方長清，丁春曉，劉小虎，王 健，張 恒， 杜 江， 李建華

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。流行病學調查顯示，每年肺癌位居惡性腫瘤新發(fā)病例的首位，在女性中位居第2位[1]。在其他國家，肺癌是美國癌癥死亡的首要原因，早期肺癌患者行手術切除治療預后較好，但該病通常早期無癥狀直到進展為晚期[2]。而在晚期患者中，肺癌組織往往會侵及周圍組織或發(fā)生轉移，當腫瘤侵犯胸膜時常常引起惡性胸腔積液(malignant pleural effusion, MPE)，甚至為血性，進而導致患者臨床上出現(xiàn)氣促等癥狀，因此，如何早期發(fā)現(xiàn)肺癌并有效控制早期肺癌的惡性進展是亟待解決的問題。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的絕大部分，組織學類型包括腺癌、鱗癌及少見的大細胞肺癌等[3]。NSCLC一般早期癥狀不明顯或僅出現(xiàn)非特異性的臨床癥狀，因此患者發(fā)現(xiàn)時多已處于中晚期。既往大量活檢組織學研究證明，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，上皮細胞-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與其密切相關，本實驗重點探討MPE中NSCLC的相關EMT免疫表型，即從細胞學角度進一步論證EMT與肺癌發(fā)生、發(fā)展的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2017年1月～2018年12月存檔的胸水標本823例。其中女性423例，年齡56～78歲，中位年齡67歲；男性400例，年齡50～87歲，中位年齡72歲。對胸水標本診斷結果為可疑陽性及異性增生細胞進行離心沉渣包埋，行HE及免疫組化染色，通過病理診斷得到107例NSCLC胸水沉渣標本，該107例通過回訪追蹤，獲得完整的臨床資料。其中男性61例，中位年齡68歲；女性46例，中位年齡71歲。

1.2 試劑鼠抗人E-cadherin、N-cadherin單克隆抗體，兔抗人vimentin、β-catentin單克隆抗體購自福州邁新公司銷售的美國Biox公司產(chǎn)品。免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 液基細胞薄層檢測(thinprep cytology test, TCT)收集新鮮胸水20 mL左右，室溫下800 r/min離心5 min，棄去上清，取沉淀底層細胞，加入清洗液后再次離心，取沉淀與保存液混合后機器自動制片，手動中性樹膠封固。

1.4 胸水沉渣包埋采用TCT常規(guī)制片、診斷后，每份對應標本收集新鮮胸水200 mL左右，經(jīng)95%乙醇固定24 h后石蠟包埋、切片。

1.5 免疫組化免疫組化染色采用SP法，PBS緩沖液代替一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

1.6 結果判定E-cadherin、N-cadherin陽性定位于細胞膜，vimentin陽性定位于細胞質，β-catentin陽性正常定位于細胞膜。在NSCLC細胞中，由于發(fā)生EMT，β-catentin膜表達減弱，胞質積聚或核異常積聚，所以在本實驗中，β-catentin判讀標準是非胞膜表達的異常陽性。陽性程度判斷：細胞無陽性著色或陽性細胞數(shù)<10%為(-)；陽性細胞數(shù)10%～25%為(+)，26%～50%為()，≥51%為()；以(+～)為陽性。每張切片隨機選取10個高倍視野(400×)，對免疫組化結果進行判讀。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件對試驗結果進行統(tǒng)計學分析，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC病例的獲得本實驗結合以下幾方面對NSCLC做出最終診斷：收集的823例胸水標本中，對TCT檢查結果為可疑陽性或細胞異型增生的標本進行胸水標本沉渣包埋，進而行免疫組化染色，肺腺癌TTF-1、Napsin A、CK7等抗體陽性，肺鱗癌CK5/6、p40、p63、CK34βE12等抗體陽性，同時針對具體病例，應用多抗體進行鑒別診斷，如應用CR、MC、CK5/6、WT-1、EGFR、D2-40等抗體鑒診NSCLC與惡性間皮瘤[4]；應用CK20、CDX2等抗體鑒別肺腺癌與轉移性結直腸腺癌；應用ER、PR等鑒診肺腺癌與轉移性乳腺癌等。最后結合患者的臨床癥狀與體征，如發(fā)病誘因(吸煙、職業(yè)和環(huán)境接觸史、電離輻射、既往肺部感染、遺傳因素等)、臨床表現(xiàn)(胸部脹痛、痰血、低熱、咳嗽等)、胸部X光片、支氣管鏡細胞學檢查及術后組織學病理檢查，最終確診107例NSCLC作為研究病例。

2.2 E-cadherin、N-cadherin、β-catentin及vimentin在NSCLC細胞組、活檢組及癌旁組織組中的表達E-cadherin在NSCLC細胞組、活檢組中的陽性率分別為28.21%(11/39)、33.34%(11/33)，均顯著低于NSCLC癌旁組織組(91.43%，32/35)(P<0.05，表1)。N-cadherin在NSCLC細胞組、活檢組中的陽性率分別為53.85%(21/39)、57.58%(19/33)，均顯著高于NSCLC癌旁組織組(14.29%，5/35)(P<0.05，表1)。β-catentin在NSCLC細胞組、活檢組中的異常陽性率分別為79.49%(31/39)、84.85%(28/33)，均顯著高于NSCLC癌旁組織組(17.15%，7/35)(P<0.05，表2)。vimentin在NSCLC細胞組、活檢組中的陽性率分別為56.41%(22/39)、63.64%(21/33)，均顯著高于NSCLC癌旁組織組(17.15%，7/35)(P<0.05，表2)。另在獲取病例進行肺癌組織學分型鑒別診斷時，TTF-1等抗體陽性為肺腺癌，CK5/6等抗體陽性為肺鱗癌(圖1)。

2.3 E-cadherin、N-cadherin、β-catentin及vimentin在NSCLC胸水細胞中的表達及與臨床病理特征的關系E-cadherin的陽性率在低分化組為6.67%(1/15)，顯著低于中+高分化組(41.67%，10/24)(P<0.05，表3)；在有淋巴結轉移組陽性率為13.04%(3/23)，顯著低于無淋巴結轉移組(50.00%，8/16)(P<0.05，表3)；N-cadherin在有淋巴結轉移組中的陽性率為69.57%(16/23)，顯著高于無淋巴結轉移組(31.25%，5/16)(P<0.05，表3)。β-catentin的異常陽性率在低分化組為100.00%(15/15)，顯著高于中+高分化組(66.67%，16/24)(P<0.05，表4)；vimentin在無淋巴結轉移組為31.25%(5/16)，顯著低于有淋巴結轉移組(73.91%，17/23)(P<0.05，表4)。以上4個抗體表達均與患者年齡、性別、吸煙史和組織學類型無關。

表1 E-cadherin、N-cadherin在NSCLC細胞組、活檢組及癌旁組織組中的表達

a.NSCLC細胞組與NSCLC活檢組相比；b.NSCLC活檢組與NSCLC癌旁組織組相比；c.NSCLC細胞組與NSCLC癌旁組織組相比

表2 β-catentin及vimentin在NSCLC細胞組、活檢組及癌旁組織組中的表達

a.NSCLC細胞組與NSCLC活檢組相比；b.NSCLC活檢組與NSCLC癌旁組織組相比；c.NSCLC細胞組與NSCLC癌旁組織組相比

ABCDEFGH圖1 NSCLC病理學與EMT相關標志物的表達:A.NSCLC胸水TCT,巴氏染色;B.NSCLC胸水沉渣包埋組織HE染色;C.E-cadherin在NSCLC胸水細胞中陽性,SP法;D.N-cadherin在NSCLC胸水細胞中陽性,SP法;E.β-catentin在NSCLC胸水細胞中陽性,SP法;F.vimentin在NSCLC胸水細胞中陽性,SP法;G.TTF-1在NSCLC胸水細胞中陽性,SP法;H.CK5/6在NSCLC胸水細胞中陽性,SP法

3 討論

目前，肺癌已成為全球癌癥相關死亡的主要原因，其中約85%的確診病例是NSCLC[5]。EMT是細胞從上皮向間質表型發(fā)生、發(fā)育轉變的過程，該過程與胚胎形態(tài)發(fā)生有關，也與癌癥的進展和轉移有關[6]，以其發(fā)生的特定生物學環(huán)境為依據(jù)將其分為三型[7]：1型，EMT主要通過間充質細胞上皮化過程產(chǎn)生次級上皮細胞，實現(xiàn)胚胎形成過程中的細胞類型多樣化；2型，通過產(chǎn)生纖維細胞以修復由創(chuàng)傷和炎癥反應造成的組織損傷；3型，原發(fā)性上皮組織腫瘤細胞形成具有遷移能力的間充質細胞，隨血流轉移至不同部位，進而形成上皮細胞的腫瘤轉移灶，該型EMT在腫瘤遷移和侵襲過程中是極其重要的一步，也是近年研究的熱點，其在形態(tài)上主要表現(xiàn)為上皮細胞失去分化特征，細胞間連接消失，細胞骨架重建，細胞失去極性，黏附力下降，進而獲得較強的侵襲和轉移能力，同時獲得了間質細胞特征，細胞形態(tài)由多邊形轉變?yōu)樗笮蔚睦w維細胞樣形態(tài)[8]。這些變化通過相關分子標志物的表達改變而顯現(xiàn)出來。

由于NSCLC早期臨床癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多已處于中晚期，此時患者也多已發(fā)生轉移，轉移是發(fā)生在一系列不連續(xù)或相對獨立的步驟中，包括侵襲、血管生成、淋巴血管空間滲透和繼發(fā)腫瘤的建立。MPE是腫瘤轉移的一種類型，對NSCLC患者通常是一種預后不良的征象[9-10]，其潛在機制比其他類型轉移引起的關注要少，在既往組織學研究中，與所有其它實體腫瘤一樣，NSCLC的發(fā)生和轉移也可以由EMT過程來闡述[11-12]，臨床上最常用的檢查樣本是來自腫瘤組織的活檢樣本，是通過閉合胸膜活檢或胸腔鏡肺活檢獲得，這些方法均意味著侵入性手術和潛在的高風險，相較于活檢標本，胸腔積液的取樣較容易、創(chuàng)傷性小且可重復，因此，有必要進一步試驗確定其能否作為組織替代物應用到腫瘤的預防與治療研究中去[13]。本實驗從細胞學入手，對比NSCLC細胞組與NSCLC活檢組各抗體的陽性率之間差異有無統(tǒng)計學意義，這提示通過沉渣包埋MPE中脫落細胞EMT各標志物的陽性結果表達同活檢組織學一樣，即表現(xiàn)為E-cadherin等上皮標志物表達降低或缺失，N-cadherin、vimentin等間葉細胞標志物陽性[14]，同時黏附蛋白的輔助分子β-catentin的入核，即異常陽性率增高(NSCLC細胞組、NSCLC活檢組各抗體陽性率均與NSCLC癌旁組比較)。這些均說明應用MPE細胞學檢測結果與活檢組織檢測結果一致，既EMT在NSCLC的轉移和侵襲中發(fā)揮重要作用，因此，通過進一步的研究和優(yōu)化，使MPE細胞作為腫瘤活檢組織的有效替代物，進而讓我們更好的理解EMT過程中腫瘤細胞的異質性和惡性生物學行為，同時為新的靶向治療藥物的研究提供新思路和新方向，以便進行更可靠、有臨床意義的腫瘤診斷和治療，將是NSCLC腫瘤學研究的新突破口。

表3 E-cadherin、N-cadherin在NSCLC胸水細胞中的表達及與臨床病理特征的關系

a.腺癌與鱗癌相比；b.鱗癌與腺鱗癌相比；c.腺癌與腺鱗癌相比；d.腺癌與大細胞癌相比

表4 β-catentin、vimentin在NSCLC胸水細胞中的表達及與臨床病理特征的關系

a.腺癌與鱗癌相比；b.鱗癌與腺鱗癌相比；c.腺癌與腺鱗癌相比；d.腺癌與大細胞癌相比