彈力纖維染色在評估胸腺瘤對縱隔胸膜侵犯的應用

秦 鋼，邢 杰，吳佳君，張 杰，韓昱晨

目前，彈力纖維(elastic fibers, EF)染色是廣泛應用于評估肺癌胸膜侵犯的方法，對肺癌的TNM分期至關重要，但在胸腺瘤診斷的實際工作中，縱隔胸膜侵犯對胸腺瘤的Masaoka-Koga分期也有重要意義。國際胸腺瘤協作組織(International Thymic Malignancy Interest Group, ITMIG)建議在尚無廣泛被接受的分期方法之前，仍使用Koga等修訂的Masaoka-Koga分期[1-3]。彈力纖維由彈力蛋白構成，在新鮮組織中呈黃色的細亮線條紋，也叫黃纖維；其纖維較細，交織成網狀，使用常規HE染色較難區分[4-5]。本文旨在探討EF染色對準確判斷胸腺瘤有無胸膜侵犯及正確評估胸腺瘤Masaoka-Koga分期的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集上海交通大學附屬胸科醫院病理科2016年手術切除的胸腺瘤標本100例，肉眼可見腫瘤與胸膜或心包粘連，其中男性56例，女性44例，年齡30～75歲，平均60.98歲；所有患者術前均未接受放、化療。每例取材6～7塊，置于10%中性福爾馬林中固定，常規脫水，包埋，3～4 μm厚連續切片2張，分別行HE染色和EF染色。

1.2 方法維多利亞藍染液配制：取一只500 mL的燒杯，加入蒸餾水200 mL、維多利亞藍2 g、糊精0.5 g、間苯二酚4 g，小火煮沸，另取一只燒杯煮沸30%三氯化鐵25 mL，將其緩慢倒入維多利亞藍混合液中，小火煮沸3 min，同時不斷攪拌直至液體呈膠體狀，冷卻后過濾，將沉渣和濾紙放入60 ℃烘箱中烤干備用；取一只干凈的燒杯放入70%乙醇400 mL溶解沉渣，加入鹽酸4 mL和苯酚6 g作為防腐劑，4 ℃冰箱放置1周成熟后即可使用。

石蠟切片脫蠟后置于70%乙醇中清洗，在維多利亞籃染液中染色90～120 min，使用95%乙醇分化，蒸餾水沖洗干凈，蘇木精染色5 min，經鹽酸乙醇濃液分化，熱水返藍，伊紅復染，蒸餾水清洗干凈后，自然干燥，中性樹膠封固。鏡下觀察彈力纖維較細，呈藍綠色波浪狀，細胞核為藍色，細胞質為紅色。

2 結果

100例胸腺瘤標本均可見腫瘤與胸膜或心包粘連，其中HE染色發現腫瘤侵犯胸膜，經EF染色發現腫瘤細胞未侵犯彈力層46例(圖1)；侵犯胸膜彈力層54例，14例通過HE染色無法準確判斷，而采用EF染色后明顯可見腫瘤細胞和胸膜之間的關系(圖2)；對于心包浸潤的判斷，HE染色顯示心包彈力板完整，但EF染色顯示腫瘤細胞已破壞心包彈力層(圖3)；也可見HE和EF染色均顯示腫瘤細胞已破壞胸膜彈力層，僅保留部分胸膜的病例(圖4)。

3 討論

目前，Masaoka-Koga是較為廣泛接受的胸腺瘤臨床分期，腫瘤細胞是否侵犯胸膜(鏡下證實)是區分Ⅱb期和Ⅲ期的重要依據，對于Masaoka-Koga分期Ⅲ和Ⅳa期胸腺瘤患者，多主張采用綜合治療，即術前化療、手術、術后化療或放療，能夠提高Masaoka-Koga分期Ⅲ和Ⅳa期胸腺瘤患者的生存期。

Masaoka-Koga對于Ⅲ期胸腺瘤的術語定義：肉眼見腫瘤侵犯鄰近器官(如心包、大血管或肺)；國際胸腺瘤協作組織則給出更為詳細的定義：包括腫瘤侵犯以下任何組織，如鏡下侵犯縱隔胸膜(無論部分或侵透彈力纖維層)，或鏡下侵犯心包(無論部分侵犯纖維層或侵透漿膜層)，或鏡下證實直接侵透臟層胸膜或侵犯肺實質，或侵犯隔神經或迷走神經(鏡下證實，僅粘連除外)，侵犯或侵透大血管結構(鏡下證實)，與肺或周圍器官粘連，且必須侵犯縱隔胸膜或心包(鏡下證實)[3]。由此可見，EF染色對判斷胸腺瘤的臨床分期同樣具有重要意義。

圖1未侵犯胸膜：A.HE染色；B.EF染色圖2A.無法準確判斷腫瘤細胞是否突破彈力層(紅色箭頭)，HE染色；B.腫瘤細胞抵達胸膜下，但未突破彈力層(紅色箭頭)，EF染色圖3A.心包彈力板完整(紅色箭頭)，HE染色；B.腫瘤細胞已破壞心包彈力層(紅色箭頭)，EF染色圖4A.HE染色(紅色箭頭)；B.EF染色(紅色箭頭)，A圖與B圖均顯示腫瘤細胞已破壞胸膜彈力層，僅保留部分胸膜

彈力纖維呈細絲狀，主要成分為彈性蛋白，屬于硬質蛋白，難以溶解，新鮮標本中呈黃色細亮條狀，HE染色時，彈力纖維呈粉色，且較難與其他纖維組織區分。EF染色的原理：間苯二酚和三氯化鐵結合成一種帶有弱正電荷的染料，通過非極性吸著與結構致密的彈力纖維緊密結合完成染色，它們之間通過氫鍵相互連接[6]。彈力纖維是血管及腫瘤間質的重要組成之一，很多疾病均可引起彈力纖維的顯著變化，如支氣管擴張、肺癌等。由于腫瘤細胞與微環境中的細胞成分相互作用，誘導纖維母細胞增生，導致臟層胸膜和腫瘤組織之間出現纖維組織及血管增生，采用常規HE染色觀察胸膜是否侵犯易被干擾。實際工作中，會遇到各種情況，如HE染色可以觀察到胸膜上有腫瘤細胞浸潤，但是無法判斷胸膜是否有腫瘤細胞浸潤；或者對于心包彈力板有無浸潤的判斷等。本組標本采用EF染色，可以清楚地判斷胸腺瘤與臟層胸膜之間的關系，尤其是各種原因導致HE染色無法判斷的14例胸腺瘤。因此，采用EF染色，可以對胸腺瘤患者進行準確分期、最佳的治療方案和預后評價均有積極的意義。