結腸癌組織中CDC6的表達及臨床意義

羅志飛，黃幼生，解 娜，楊 丞，阮細玲，張藝馨，王惟江，王敏健

結腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲、轉移是提高患者生存率的重要途徑，尋找結腸癌增殖、侵襲、轉移的分子靶標對判斷預后、設計靶點藥物及提高治療水平具有重要意義[1]。CDC6屬于ATP酶家族成員之一，是形成復制前復合物的主要成分，參與DNA復制，促進細胞周期轉換，誘導細胞增殖[2-3]，在多種腫瘤中存在高表達[4-8]，但在結腸癌組織中的表達尚不清楚。本文應用免疫組化MaxVision法檢測CDC6在結腸癌組織中的表達，并分析其與結腸癌臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011～2012年海南醫學院第一附屬醫院病理科存檔的121例結腸癌標本，所有病例均有完整的臨床病理資料，其中73例有5～6年的隨訪資料，患者術前均未接受放、化療。本實驗采用AJCC第8版對結腸癌進行病理分期。

1.2 組織芯片制作以結腸癌、癌旁正常黏膜組織制作芯片，光鏡下選擇HE標本進行定位、標記(避免出血、壞死等部位)。每個標本取2個位點，按18×12的陣列按順序排放，在陣列孔的左上方第一排的第一個孔放置正常肝組織，避免混淆。

1.3 免疫組化采用免疫組化MaxVision法進行染色。常規切片、脫蠟、水化，經3%H2O2封閉內源性過氧化物酶5 min。1 mmol/L Tris-EDTA(pH 8.0)煮沸修復30 min，CDC6一抗(1 ∶400，Abcam公司)37 ℃ 1 h。PBS清洗5 min×3次，二抗(福州邁新公司)孵育20 min。PBS清洗5 min×3次，DAB顯色(福州邁新公司)，蘇木精襯染1 min。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判讀CDC6陽性著色為細胞質及細胞核著色，呈棕黃色至棕褐色。根據細胞著色強度計分：淺棕色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分；根據陽性細胞數百分比計分：<5%為1分，≥5%為2分。兩者評分結果相乘作為最終評判：<3分為低表達，≥3分為高表達。

1.5 統計學分析采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，計數資料用百分比或率表示，采用χ2檢驗；CDC6表達與結腸癌臨床病理特征的關系采用χ2檢驗比較；應用Kaplan-Meier進行生存曲線描繪，并用Log-rank檢驗進行比較分析，以Cox回歸模型進行多因素分析，篩選預后相關因素。顯著性檢測水準α值=0.05，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDC6在結腸癌及癌旁正常黏膜組織中的表達在癌旁正常黏膜組織中，CDC6不表達或低表達，均為細胞核著色，陽性率為5.79%(7/121)。CDC6在結腸癌組織為細胞質、細胞核雙表達，以細胞質表達為主，陽性率為80.2%(97/121)，細胞核陽性率為29.8%(36/121)，總陽性率為93.39%(113/121)，強陽性率為68.60%(83/121)；與癌旁正常黏膜組織相比，差異有顯著性(P<0.001，圖1)。

2.2 CDC6表達與結腸癌臨床病理特征的關系CDC6的表達與臨床分期及遠處轉移明顯相關(P<0.05)；與淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)，N0+N1期結腸癌CDC6表達強度明顯低于N2期結腸癌，差異有顯著性(P<0.05)；但CDC6表達與患者性別、年齡等無關(P>0.05，表1)。

2.3 CDC6表達與結腸癌患者預后的關系121例結腸癌患者中93例進行隨訪，其中73例有完整的5年隨訪資料，對73例進行Kaplan-Meier法生存分析，結果顯示CDC6高表達組的中位生存期(54.49個月)明顯低于低表達組(69.09個月)，差異有統計學意義(F=4.07，P=0.047)；CDC6低表達組5年生存率為81.82%(18/22)，明顯高于高表達組54.9%(28/51)，差異有顯著性(χ2=17.19，P<0.01，圖2)。

圖1CDC6在結腸癌、癌旁正常黏膜組織中的表達，MaxVision法：A.例1癌旁正常黏膜組織中CDC6呈陰性；B.例1結腸癌組織CDC6細胞呈陽性；C.例2癌旁正常黏膜組織中CDC6呈陰性；D.例2結腸癌組織中CDC6呈細胞核、細胞質陽性；E.例3癌旁正常黏膜組織中CDC6呈陰性；F.例3結腸癌組織中CDC6呈細胞核陽性

表1 結腸癌臨床病理特征與CDC6表達的關系

2.4 結腸癌患者預后Cox多因素分析經χ2檢測，結腸癌患者生存狀態與臨床分期、腫瘤分級、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及CDC6高表達相關(表2)。進一步Cox多因素回歸分析表明腫瘤遠處轉移、臨床分期及CDC6高表達是結腸癌預后的獨立風險因素(表3)。

表2 結腸癌臨床病理特征、CDC6表達與預后的關系

表3 Cox回歸模型分析結腸癌患者預后

圖2 CDC6表達結腸癌患者的生存曲線

3 討論

細胞周期紊亂是腫瘤最主要的發生機制之一。結腸癌中也存在多種基因異常導致其細胞周期紊亂[2]。CDC6基因位于人類基因17q21.2，真核細胞中CDC6蛋白是ATP結合蛋白和復制前復合體(pre-replication complexes, pre-RC)成員，是細胞起始DNA復制的必需蛋白[2]；其主要功能是結合起始識別復合物(ORC)、CDT1和MCM復合體(含MCM2-7蛋白)，以ATP依賴的方式組裝在ORC后，將MCM蛋白加載到DNA上，促進細胞從G1期進入S期[2-3]。除起始DNA復制外，CDC6還可抑制有絲分裂期細胞周期蛋白CDK1的活性，影響細胞分裂增殖，參與細胞惡性轉化[3,6]。CDC6在正常組織細胞復制時，僅在G1期呈瞬時高表達；在腫瘤組織中卻存在持續高表達，促進細胞周期轉換，誘導細胞增殖。已有研究發現，CDC6在肝癌[5]、子宮頸癌[6]、乳腺癌[7]等多種惡性腫瘤中高表達。本實驗發現CDC6在結腸正常組織中表達缺失；或在結腸隱窩底部呈散在核表達；在大部分結腸癌組織中呈細胞質和細胞核的高表達，可促進細胞持續G1/S期轉換，進而導致結腸上皮惡性轉化。

呂波等[5]報道CDC6的高表達可促進腫瘤轉移，如肝癌的淋巴結轉移患者其腫瘤組織中CDC6表達明顯升高。Deng等[9]采用免疫組化法研究發現，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中CDC6蛋白水平升高，CDC6表達與FIGO分期、分化程度、腹水、腹水惡性腫瘤細胞及淋巴結狀態顯著相關。本實驗結果顯示，CDC6的高表達與結腸癌患者淋巴結轉移數量、臨床分期及遠處轉移密切相關；高表達CDC6患者生存期明顯低于CDC6低表達患者，Cox回歸分析提示，CDC6高表達是結腸癌預后的獨立風險因素。

CDC6過表達能促進腫瘤增殖，有研究認為可能與CDC6高表達抑制癌細胞凋亡有關[9-11]。CDC6的過表達能通過調控BCR/ABL信號通路抑制慢性髓系白血病細胞凋亡[10]。Karanika等[11]研究認為CDC6過表達顯著降低AR信號抑制劑Enzalutamide和Chk1/2抑制劑AZD7762誘導的細胞凋亡，在進展性前列腺癌中表達增加，通過抑制AR-CDC6-ATR-Chk1信號通路，能靶向前列腺癌的DNA損傷應答。在體外血清饑餓釋放過程中卵巢癌細胞系HO8910細胞內CDC6、Cyclin D1和PCNA的表達上調，而p16的表達下調。此外，下調CDC6可降低細胞增殖和集落形成[9]；提示CDC6可作為惡性腫瘤潛在的治療靶點。

CDC6在結腸癌中的作用報道較少，羅金現等[12]分別對結直腸癌顯著差異的基因作GO富集、KEGG通路以及蛋白質相互作用網絡分析，篩選出CDC6等多個與結直腸癌發生、發展關系密切的關鍵基因。應用TCGA數據庫信息學分析CDC6在各腫瘤中的表達豐度，發現CDC6在結腸癌中表達明顯高于正常組織，本實驗結果證實CDC6在結腸癌組織中高表達，與結腸癌轉移、分期及預后不良有關，然而其具體作用機制尚不明確，進一步深入分析將有助于闡明結腸癌發生、發展機制，為結腸癌治療提供新的治療靶點。