低濃度過氧化氫溶液在高溫時用于組織脫黑色素的效果

陳永華，林碧蕓，李小芳，李南紅，袁振興

臨床上含有黑色素的腫瘤較多，良性的有痣，惡性的有黑色素瘤、原始神經外胚層腫瘤、透明細胞肉瘤等，免疫組化是鑒別上述腫瘤的重要輔助手段，然而黑色素的存在，嚴重影響免疫組化結果的判讀。因此，尋找一種對組織結構及免疫組化指標表達影響盡可能小的脫黑色素方法對病理診斷意義重大。目前，常用的脫色素法有高錳酸鉀/草酸法和過氧化氫法，均可以把色素脫除干凈，但是會破壞組織。本科室采用兩種pH的溶劑配制濃度為1.8%的H2O2溶液在70 ℃時對組織進行脫色素處理，并行免疫組化染色，取得良好效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取我院2015年1月～2017年12月病理確診為黑色素瘤，且富含黑色素顆粒的12例存檔蠟塊。另選取3例HE染色顯示極少黑色素的黑色素瘤作為對照組。

1.2 試劑雙氧水消毒液購自南國藥業公司，分析純氫氧化鈉購自天津凱通化學公司，PBS、一抗Ki-67、HMB-45及免疫組化MaxVison試劑盒，均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1實驗分組 所有標本均經10%中性緩沖福爾馬林固定8～36 h，常規脫水、透明和石蠟包埋，4 μm厚切片，每例蠟塊切9張白片，用氨丙基三乙氧基硅烷(APES)黏附載玻片撈片，經65 ℃烤片2 h。實驗分為未處理組、PBS組、NaOH組。

1.3.2脫黑色素 富含黑色素組織與極少色素組織分別切片于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，梯度乙醇水化，自來水沖洗并浸泡于蒸餾水中待用，若手工方法做免疫組化染色，切片經抗原修復后冷卻至室溫，水洗待用，經預先在水浴箱孵育至70 ℃分別由PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制濃度為1.8%的H2O2溶液，每隔10 min取出鏡下觀察，直至黑色素完全褪去，記錄時間。若150 min內未褪去全部黑色素，亦停止脫黑色素。不做脫色素處理的切片脫蠟至水即可，然后復染蘇木精，脫水、透明、封固。

1.3.3免疫組化 富含黑色素組織與極少色素組織分別選取Ki-67、HMB-45抗體行免疫組化染色。(1)未處理組：組織切片抗原修復至常溫后，切片滴加過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；除去PBS后，滴加一抗室溫下孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次，采用免疫組化MaxVison法進行檢測。(2)脫黑色素組：切片經抗原修復后，PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制濃度為1.8%的H2O2溶液處理，流水沖洗10 min，采用免疫組化MaxVison法進行檢測(圖1)。

圖1 實驗步驟示意圖

2 結果

未處理組的切片，經脫蠟復染蘇木精后組織可見大量棕黃色的黑色素顆粒覆蓋在腫瘤細胞上，進行免疫組化染色時黑色素顆粒與DAB顯色的顏色互相混淆，無法分辨(圖2)。

本實驗是溫度為70 ℃時玻片經脫黑色素處理后，所有組織在PBS(pH 7.4～7.6)配制的1.8%H2O2溶液中100～130 min黑色素可完全脫去，且組織結構完整，無脫片現象；在NaOH(pH 10.0)配制的溶液經70～90 min黑色素可完全脫去，組織結構基本完整，組織稍有卷曲。兩種脫色素處理后的切片均行免疫組化HMB-45染色，可見腫瘤細胞的胞質呈棕黃色，免疫組化Ki-67染色可見部分細胞核呈棕黃色(圖2)。

極少黑色素組中未做處理與兩種pH溶劑配置的1.8% H2O2溶液處理的蘇木精復染與免疫組化染色結果基本一致。

3 討論

黑色素是一種黃褐色或棕褐色的細顆粒，大小不等，形狀不一，性質穩定，來源于神經脊，在胚胎發育過程中，由神經脊移行到皮膚等處。正常情況下黑色素存在于毛發、皮膚基底層等，在病理情況下，黑色素多見于惡性黑色素瘤及一些良性病變，如色素痣等。免疫組化染色應用DAB顯色系統時，黑色素顆粒的存在會影響組織病理學評估。因此，需進行脫黑色素處理。

顏亞暉等[1]在標本脫水前就進行脫黑色素處理獲得較好的效果，但該方法耗時較長，且脫黑色素時間與黑色素的含量呈正比，脫色時間難以掌握。吳瓊等[2]在常規免疫組化染色DAB步驟后，應用甲苯胺藍溶液或Giemsa溶液把黑色素復染為可以區分DAB色素中的黑色素顆粒。該方法將腫瘤細胞表達抗原用DAB染成棕色并將黑色素顆粒染成墨綠色或者綠色，當黑色素較少且無覆蓋組織時效果較好；若黑色素較多時，染色后的黑色素顆粒，物理遮蓋的問題仍然存在，遮蓋物會影響免疫組化結果的判斷。因此，不適用于含大量黑色素的組織。高錳酸鉀-草酸脫黑色素是使用最廣泛的漂白方法，雖然其快速有效，但于曉東等[3]認為傳統的高錳酸鉀法容易掉片，在加熱煮沸的情況下易加劇脫片的幾率[4]，且漂白使組織損傷和細胞分子丟失，后續免疫組化染色的強度與定位受影響較大[5]。

圖2 富含黑色素的未處理組與PBS、NaOH組處理脫色素景深掃描及免疫組化HMB-45、Ki-67染色，MaxVision法

H2O2法也常用于脫黑色素，室溫下對組織的抗原性基本無影響，但耗時較長，無法滿足臨床診斷的需求[3,6]。陳瓊榮等[7]采用3% H2O2在55 ℃處理2 h嚴重脫片。本實驗選取1.8% H2O2溶液，把溫度提高至70 ℃，經實驗驗證組織完全脫去色素后，結構完整，無脫片現象，且對后續免疫組化指標Ki-67及HMB-45染色無影響。

本科室經過反復實驗，采用PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制的1.8% H2O2溶液在70 ℃時經70～130 min將色素脫干凈，組織結構完整。極少黑色素組未做處理與兩種pH溶劑配置1.8% H2O2溶液處理的蘇木精復染與免疫組化結果基本一致，證明兩種脫黑色素法在完全脫去黑色素的時間內對免疫組化染色的影響較小。該方法能夠滿足臨床、病理醫師對含有黑色素腫瘤的診斷及鑒別診斷，耗時較短，值得推廣應用。