HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌中的表達及與預后的關系

劉艷梅 楊琪 王賽賽 應申鵬

宮頸癌是女性第三大惡性腫瘤，病死率在世界女性癌癥中位居第四[1]。在我國，雖然隨著衛生條件的不斷改善，宮頸癌的發病率及死亡率呈明顯下降趨勢，但是據前幾年統計，每年平均仍新增病例約13萬例，占現有病例數的三分之一，每年因宮頸癌死亡的人數有6萬之多[2]。所以，如何提高宮頸癌的治愈率，是目前需要解決的重要課題。目前，局部晚期宮頸癌患者的標準治療模式為同步放化療，該模式雖然能使患者5年生存率提高6%，但仍有接近三分之一的患者會出現局部復發或遠處轉移。

缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）是一種異二聚體轉錄因子，由結構同源的α亞基和共同的β亞基組成。研究發現，哺乳動物中HIF主要有3種亞基（HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α），而目前對于 HIF-1α 和HIF-2α蛋白研究較多。Li等[3]研究報道，缺氧環境會激活HIF，而HIF通過激活靶基因來促進腫瘤的發生、發展及耐藥。筆者團隊前期研究結果也提示HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌中呈高表達[4]。本研究將進一步探究了宮頸癌中HIF-1α和HIF-2α蛋白的表達特點及其與疾病預后的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 將2010年1月至2015年12月本院放療科收治的宮頸癌患者68例設為實驗組，年齡37～90歲，平均（68.10±15.27）歲；以本院 2013年 1月至 2015年12月收治的30例宮頸良性病變患者作為對照組，年齡28～43歲，平均（35.2±4.31）歲。每例患者治療前均經宮頸活檢留取3塊組織，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。所有患者取樣前均經病理學檢查明確診斷，且未經過放療或化療。

1.2 主要試劑 HIF-α多克隆抗體購于Abcam公司（批號：BA09541）；免疫組化相關試劑盒及二抗均購于北京中杉金橋公司；實驗其他相關試劑均購于溫州長豐生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測HIF-1α和HIF-2α蛋白表達 所有蠟塊標本均行4μm切片，68℃烘烤2h，先后經過抗原修復、封閉，依次加入一抗50～100μl（HIF-1α蛋白抗體稀釋比例1:100、HIF-2α蛋白抗體稀釋比例1:250），二抗 40～50μl，37℃孵育 1h，顯色、復染、脫水，封片后顯微鏡下觀察，由本院2位有經驗的病理科醫師讀片。HIF-1α和HIF-2α蛋白表達陽性為細胞質或細胞核中呈棕黃色顆粒，綜合陽性細胞所占比例及著色強度得出最終評分。評判標準：（1）陽性細胞評分：＜1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；（2）著色強度計分：0分（未染色），1分（弱染色），2分（中染色），3分（強染色）。兩個分值相加為最終評分：0～1 分（-）、2～3 分（+）、4～5 分（++）、6～7 分（+++），其中（++）和（+++）記為陽性。

1.4 患者隨訪 詳細登記每例患者的免疫組化結果，并在治療后完成規律隨訪，詳細記錄患者復查結果[5]。

1.5 統計學處理 應用SPSS 23.0統計軟件。計量資料以表示；計數資料以百分數表示，組間比較采用χ2檢驗，HIF-1α和HIF-2α蛋白表達的相關性分析采用Spearman秩相關，生存分析采用Kaplan-Meier繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達 免疫組化檢測結果見圖1。實驗組中HIF-1α及HIF-2α蛋白的陽性率均明顯高于對照組（均P＜0.01），見表 1。

圖1 HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達（a:HIF-1α蛋白在正常宮頸組織中的表達；b：HIF-1α蛋白在宮頸癌組織中的表達；c：HIF-2α蛋白在正常宮頸組織中的表達；d：HIF-2α蛋白在宮頸癌組織中的表達；免疫組化染色，×200）

表1 兩組患者宮頸癌組織中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達間比較[例（%）]

2.2 宮頸癌組織中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達的相關性 68例宮頸癌組織HIF-1α和HIF-2α蛋白表達雙陽性31例，雙陰性的9例，HIF-1α蛋白陽性而HIF-2α蛋白陰性11例，HIF-1α蛋白陰性而HIF-2α蛋白陽性17例，兩者表達無明顯相關性（r=0.89，P＞0.05）。

2.3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達與宮頸癌患者的年齡、腫瘤大小、鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）抗原水平均無關（均 P ＞0.05）；但與淋巴結轉移及放療前貧血均有關（均P＜0.05），另外，HIF-2α蛋白表達與腫瘤分期亦有關（P＜0.05），見表2。

2.4 宮頸癌患者HIF-1α和HIF-2α蛋白表達與預后的關系 截止2018年6月，HIF-1α蛋白陰性者的中位無病生存期（DFS）和總生存期（OS）分別為 79.53和80.23個月，長于HIF-1α蛋白陽性者的50.7和49.23個月，其中OS具有統計學差異（P＜0.05）。HIF-2α蛋白陰性者的中位DFS和OS分別為70.57和72.77個月，長于HIF-2α蛋白陽性者的50.7和49.63個月，但均無統計學差異（均P＞0.05），見圖2。進一步根據HIF-1α和HIF-2α蛋白表達不同組合進行分組比較，結果均無統計學差異（均 P＞0.05），見表3、圖3。

表2 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

宮頸癌的發病率及死亡率仍然逐年攀升，嚴重威脅著女性的健康[6]。眾所周知，宮頸癌的發生、發展是個復雜的過程，有報道認為氧化應激（reactive oxygen species，ROS）在腫瘤的形成與發展過程中發揮著重要作用[7]，腫瘤細胞均處于缺氧環境，為了維持自身繁殖，腫瘤細胞通過活化細胞信號通路以適應缺氧狀態[8]。缺氧環境激活轉錄因子HIFs、生長因子受體活化磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等信號通路，從而使腫瘤細胞適應缺氧環境，促進腫瘤發生發展及對治療的耐藥。筆者前期工作已初步證實，宮頸癌中HIF-1α與HIF-2α蛋白同時存在高表達，本研究在此基礎上，通過擴大樣本量，深入分析它們的表達情況與宮頸癌患者臨床病理特征的關系，并進一步分析其對宮頸癌患者預后的影響。

圖2 HIF-1α和HIF-2α蛋白陽性與陰性表達宮頸癌患者的生存曲線

表3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達不同組合宮頸癌患者預后的比較

圖3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表達不同組合宮頸癌患者的生存曲線

HIF是一組由同源的α亞基，以及共同的β亞基組成的異二聚體轉錄因子[9]，目前研究得較多的是HIF-1α和HIF-2α蛋白。HIFs可通過誘導腫瘤血管生成、細胞能量代謝等相關基因的表達而促進腫瘤的發生[10]。既往研究證實，大多數實體瘤中都存在HIFs高表達[11]。本研究結果顯示，宮頸癌組織中同時存在著HIF-1α和HIF-2α蛋白的高表達，再一次證實HIFs在實體瘤的發生、發展中起著重要作用。HIF-1α和HIF-2α蛋白有著42%的相同氨基酸序列，但是兩者的作用機制仍然存在差別，HIF-1α蛋白主要調控血管新生，而HIF-2α蛋白主要調控血管功能。本研究再次證實了HIF-1α和HIF-2α蛋白在宮頸癌組織中的表達無相關性，與馬麗等[12]在胃癌中的研究結果一致，提示在腫瘤的發生、發展中，兩者可能具有不同的作用。同時，本研究進一步發現，HIF-1α蛋白高表達與宮頸癌患者的淋巴結轉移及放療前貧血呈正相關，而與患者年齡、腫瘤大小、SCC抗原及FIGO分期等無相關關系；而HIF-2α蛋白的高表達除了與淋巴結轉移及放療前貧血呈正相關，還與FIGO分期相關，這個結果再次提示HIFs在腫瘤的發生、發展中可能起著不同的作用。

除此之外，本研究還探討了HIFs的表達水平與宮頸癌患者預后的關系，發現HIF-1α蛋白表達陽性的患者中位DFS及OS均差于表達陰性的患者，同時OS具有統計學差異。Zhang等[13]通過對236例胃癌的研究發現，HIF-1α蛋白在胃癌中高表達，尤其在復發的胃癌患者中表達水平較高，推測其是預后不良的指標，可能促進腫瘤的進展，這與本研究的結果類似。Li等[14]在骨肉瘤中發現HIF-2α蛋白的高表達可能預示著預后不良，Yang等[15]對肝癌的研究卻得到了相反的結論，認為HIF-2α蛋白的高表達與肝癌患者預后呈正相關。而本研究發現HIF-2α蛋白陽性患者的DFS及OS均明顯短于陰性患者，但無統計學差異，這可能與本研究患者以局部晚期為主有關，下一步研究將擴大樣本量，增加不同分期的患者再進行分析。此外，本研究進一步根據兩者的表達狀態將患者分為兩者雙陽性、HIF-1α蛋白陽性、HIF-2α蛋白陽性、兩者雙陰性4組，進一步比較發現單陽性及兩者雙陰性的患者DFS和OS均長于雙陽性患者，但統計學處理提示無統計學差異，可能與分組樣本量較少有關。但是此結論初步提示HIF-1α和HIF-2α蛋白的表達可能預示著宮頸癌患者的不良預后，為今后分子水平的研究提供了一個方向[16]。

綜上所述，本研究進一步得出結論，在宮頸癌組織中存在HIF-1α和HIF-2α蛋白的高表達，兩者的高表達可能預示著患者的預后不良，但它們在宮頸癌發生、發展中的作用以及具體機制有待進一步研究。