MEK抑制劑在K-RAS基因突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞中的耐藥機制

金劍英 朱延安 謝靜靜 金丹

人類1/3的癌癥與RAS基因突變有關(guān)[1]。v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（K-RAS）蛋白是RAS家族中的一員，可調(diào)控分子信號通路，從而影響細(xì)胞分化和增殖[2]。K-RAS易發(fā)生基因突變，是人類腫瘤常見的致病原因。在所有腫瘤中，K-RAS基因突變發(fā)生率約為20%，常見于胰腺癌、結(jié)直腸癌（CRC）、肺癌等惡性實體腫瘤。在世界范圍內(nèi)，CRC患病率呈不斷增長趨勢[3]。對CRC患者采取放化療或手術(shù)切除等治療后，復(fù)發(fā)率仍較高[4]。這是因為CRC患者發(fā)生K-RAS基因突變后，易產(chǎn)生耐藥，常規(guī)治療手段難以奏效。有研究表明，K-RAS基因突變是CRC發(fā)生、發(fā)展及耐藥的主要驅(qū)動基因之一[5]。在CRC患者中，K-RAS基因突變發(fā)生率為20%～50%，最常見突變?yōu)镚12D、G12V和G13D。根據(jù)腫瘤細(xì)胞耐藥機制激活的途徑來克服腫瘤耐藥，是當(dāng)前腫瘤治療的研究熱點[6-7]。有研究表明，絲裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）抑制劑曲美替尼（Trametinib）對RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因（BRAF）變異的黑色素瘤具有良好的治療效果[8]。2015年美國食品藥品管理局正式批準(zhǔn)Trametinib聯(lián)合BRAF抑制劑維羅非尼（Vemurafenib）治療BRAF變異的黑色素瘤[9]。亦有文獻(xiàn)報道，MEK抑制劑考比替尼（Cobimetinib）通過腫瘤細(xì)胞RAS/Raf/MEK/ERK信號通路有選擇地使MEK激酶失活，從而阻斷RAS/Raf通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)PKC和PI3K通路激活，進(jìn)而誘導(dǎo)p53上調(diào)的凋亡調(diào)節(jié)物（PUMA）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，能有效治療CRC[10]。本研究對MEK抑制劑Trametinib在K-RAS基因突變的CRC細(xì)胞中的耐藥機制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑 K-RAS基因突變型CRC細(xì)胞株LS174T（G12D）、DLD-1（G13D）、HCT116（G13D）均購自上海細(xì)胞庫。MEK抑制劑Trametinib（M8697-10UG）、JAK2/STAT3 抑制劑魯索替尼（Ruxolitinib，SAB4300123）或LY5（GW21465）均購自美國Sigma-Aldrich公司，臨用前使用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到終濃度。RPMI1640培養(yǎng)基（61870044）、胎牛血清（FBS，12662011）均購自美國 Gibco BRL 公司；p-STAT3（Y70562214）、STAT3（KHO0481）、p-ERK1/2（KHO058）、GAPDH 抗 體（EPR16891）均購自美國Cell Signaling公司。DMSO（DZ0231）購自AMRESCO公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將LS174T、DLD-1、HCT116細(xì)胞株置于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳一代。

1.3 Trametinib對K-RAS基因突變的CRC細(xì)胞中STAT3的激活作用檢測 采用Western blot法。用Trametinib（1、5、10μM 濃度）處理 LS174T、DLD-1、HCT116細(xì)胞，檢測其STAT3上游蛋白JAK2、JAK3、Src等是否激活。預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3遍，蛋白裂解液提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白；然后進(jìn)行蛋白濃度測定，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，電泳。免疫反應(yīng)：封閉，孵育一抗，洗滌，孵育二抗，洗滌；應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對信號進(jìn)行評價。實驗重復(fù)3次。

1.4 HCT116細(xì)胞 p-STAT3Y705、STAT3和 p-ERK1/2表達(dá)檢測 采用Western blot法。分別用Trametinib（5μM）、Ruxolitinib（2.5μM）/LY5（1μM）或 Trametinib（5μM）+Ruxolitinib（2.5μM）/LY5（1μM）處理 HCT116 細(xì)胞 24h，檢測其p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表達(dá)。實驗步驟同1.3，重復(fù)3次。

1.5 HCT116細(xì)胞增殖能力檢測 采用磺酰羅丹明B蛋白染色實驗。分別用 Trametinib（5μM）、LY5（1μM）或Trametinib（5μM）+LY5（1μM）處理 HCT116 細(xì)胞 24h，去上清液，按細(xì)胞密度1 000個/孔接種于60mm孔盤中，再用新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)2周。10%冷的三氯乙酸固定細(xì)胞，4℃放置1h，反復(fù)用蒸餾水洗，待自然干燥。每孔加入冰醋酸配制的磺酰羅丹明B溶液100μl，室溫下染色15min，流水緩慢洗去染液，空氣下自然干燥。在100倍顯微鏡下觀察。以DMSO為參照，計算細(xì)胞增殖率。實驗重復(fù)3次。

1.6 HCT116、DLD-1細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞遷移劃痕實驗。先用記號筆在6孔板上均勻地劃橫線，然后按細(xì)胞密度1×105個/孔（預(yù)實驗中設(shè)不同的細(xì)胞濃度）分別接種HCT116、DLD-1細(xì)胞。劃痕后分別用Trametinib（1μM）、LY5（1μM）或 Trametinib（1μM）+LY5（1μM）處理細(xì)胞 60h，放入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取樣，在顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞遷移情況。以DMSO為參照，計算細(xì)胞遷移率。實驗重復(fù)3次。

1.7 HCT116、DLD-1細(xì)胞生存率檢測 采用MTT實驗。分別用 Trametinib（1 或 5μM）、LY5（0.5 或 1μM）、Trametinib（1或5μM）+LY5（0.5或 1μM）處理 HCT-116、DLD-1細(xì)胞；無藥物處理、常規(guī)培養(yǎng)的HCT-116、DLD-1細(xì)胞作為陰性對照。在37°C、5%CO2的條件下分別培養(yǎng)48、72h，將96孔板置于離心機1 500r/min離心5min，除去培養(yǎng)基，加入MTT溶液25μl（5mg/ml）。然后在37°C條件下孕育4h，將微滴板置于離心機1 500r/min離心5min，除去含MTT溶液的培養(yǎng)基，加入DMSO溶解晶體（10μg/孔），振蕩 10min。在 492nm 處用 Bio-Rad M450酶標(biāo)儀測量各孔吸光度（OD），取3孔OD值的均數(shù)計算細(xì)胞生存率。生存率=OD實驗組/OD對照組×100%。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Trametinib對K-RAS基因突變的CRC細(xì)胞中STAT3的激活作用 在HCT116、LS174T和DLD-1細(xì)胞中，Trametinib可明顯抑制ERK1/2的磷酸化，同時誘導(dǎo)p－STAT3Y705增加，見圖1。同時發(fā)現(xiàn)Trametinib誘導(dǎo)STAT3上游激酶p-JAK2高表達(dá)。初步提示激活JAK2/STAT3信號通路可促進(jìn)CRC腫瘤生長，同時引起對MEK抑制劑的反饋性耐藥。

圖1 不同濃度Trametinib激活K-RAS基因突變的CRC細(xì)胞后STAT3表達(dá)的電泳圖（T1為1μM濃度的Trametinib；T5為5μM濃度的Trametinib；T10為10μM濃度的Trametinib）

2.2 聯(lián)合用藥對HCT116細(xì)胞p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表達(dá)的影響 在HCT116細(xì)胞中，Trametinib+Ruxolitinib/LY5可同時阻斷 p-STAT3Y705、p-ERK1/2的激活，見圖2；提示可能發(fā)揮協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

圖2 聯(lián)合用藥后HCT116細(xì)胞p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表達(dá)的電泳圖（R2.5為2.5μM濃度的Ruxolitinib；T5為5μM濃度的 Trametinib；L1為1μM濃度的LY5）

2.3 聯(lián)合用藥對HCT116細(xì)胞增殖能力的影響 Trametinib、LY5、Trametinib+LY5 組 細(xì) 胞 增 殖 率 分 別 為62.11%、31.30%和9.95%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中Trametinib+LY5組明顯低于單藥組（均P＜0.05），見圖3。

2.4 聯(lián)合用藥對HCT116、DLD-1細(xì)胞遷移能力的影響在 HCT116 細(xì)胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5 組細(xì)胞遷移率分別為69.8%、52.8%、7.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在 DLD-1 細(xì)胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5組細(xì)胞遷移率分別為66.0%、62.0%、4.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖3 聯(lián)合用藥對HCT116細(xì)胞增殖能力的影響

圖4 聯(lián)合用藥對HCT116、DLD-1細(xì)胞遷移能力的影響（顯微鏡下，×100）

2.5 聯(lián)合用藥對HCT116、DLD-1細(xì)胞生存率的影響 在 HCT116、DLD-1細(xì)胞中，Trametinib+LY5組細(xì)胞生存率明顯低于單藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 1～2。

表1 不同劑量Trametinib和LY5處理HCT-116細(xì)胞72h后細(xì)胞生存率（%）

表2 不同劑量Trametinib和LY5作用于DLD-1細(xì)胞48h后細(xì)胞生存率（%）

3 討論

到目前為止，化療和靶向藥物治療是晚期CRC的主要治療方法。靶向治療CRC的EGFR單克隆抗體主要為帕尼單抗、西妥昔單抗，與內(nèi)源性配體競爭性抑制EGFR轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究證明EGFR單克隆抗體對K-RAS基因突變型CRC患者無效[11]。K-RAS蛋白屬于EGFR信號通路下游的小分子G蛋白，KRAS基因發(fā)生突變會引起該信號通路異常活化，從而使EGFR單克隆抗體和EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療無效。所以，針對K-RAS突變體的藥物研究具有廣闊的前景，將為EGFR抑制劑耐藥患者帶來更好的治療效果。

K-RAS抑制劑作用于RAS/Raf/MEK/ERK細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路上游基因，其成功開發(fā)進(jìn)一步促進(jìn)了對KRAS基因突變的CRC治療研究。30多年來，科學(xué)家們認(rèn)識到RAS編碼蛋白的基因突變是最強大的癌癥驅(qū)動因素之一[11-12]。可是，經(jīng)過幾十年的研究，仍未開發(fā)出一種能夠安全阻止RAS蛋白活性的藥物。K-RAS被認(rèn)為是科學(xué)界最重要的癌基因，廣泛認(rèn)為無藥物可以使用[13]。由于K-RAS基因突變靶向方向研究無果，人們開始轉(zhuǎn)于靶向K-RAS的下游信號通路的研究。K-RAS通過下游效應(yīng)途徑（如MEK/ERK、STAT3和PI3K/AKT等途徑）進(jìn)行信號傳遞[14]。在K-RAS基因突變的腫瘤細(xì)胞中，MAPK信號在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用比PI3K更重要。藥物開發(fā)的重點是經(jīng)典的RAS激活的MAPK通路，MEK 1/2在MAPK信號通路促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生、增殖和凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[10]。Trametinib已被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤[15-17]。Trametinib可作為晚期CRC切除和轉(zhuǎn)移的一線輔助治療手段，或者結(jié)合化療藥物使用。在未來10年，其他MEK抑制劑有望被批準(zhǔn)作為晚期CRC的一線治療藥物。

鑒于MEK抑制劑Trametinib在臨床治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和不能手術(shù)治療的黑色素瘤患者的優(yōu)勢，科學(xué)家提出采用K-RAS下游MEK抑制劑治療K-RAS基因突變等EGFR抑制劑耐藥的CRC患者[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然MEK抑制劑可以減緩K-RAS基因突變的CRC細(xì)胞生長，但不能殺死癌細(xì)胞，它們最終能通過一條備用信號通路繼續(xù)生存并保持旺盛生長。MEK抑制劑Trametinib在CRC中可以誘導(dǎo)STAT3磷酸化/激活。MEK抑制劑與STAT3抑制劑聯(lián)合使用，可明顯抑制癌細(xì)胞生長。本研究結(jié)果提示，MEK抑制劑和STAT3抑制劑聯(lián)用治療CRC的效果明顯優(yōu)于單用MEK抑制劑或STAT3抑制劑。

綜上所述，筆者初步發(fā)現(xiàn)在K-RAS基因突變的CRC中，MEK抑制劑可明顯抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成，減弱腫瘤細(xì)胞增殖能力和遷移能力，其機制可能與抑制ERK1/2的磷酸化、誘導(dǎo)p-STAT3Y705增加和STAT3上游激酶p-JAK2高表達(dá)、激活STAT3信號通路有關(guān)，但是兩者具體機制仍需要進(jìn)一步研究明確。