載紫杉醇重組高密度脂蛋白微球的制備和抗胃癌作用研究

王青 楊覓

在我國，大多胃癌患者初診即為Ⅳ期，5年生存率低于5%[1]。而現今的胃癌化療面臨諸多難題：首先，現有化學藥物治療對腫瘤無靶向性；其次，抗腫瘤療效與藥物劑量相關，全身給藥途徑不能使藥物局部濃度增加，因而效果不盡人意。載藥納米微球可通過在特定的組織細胞中駐留并緩慢釋放藥物而發揮靶向治療作用，從而達到較好的治療效果[2-4]。目前，美國食品藥品監督管理局已批準鹽酸阿霉素脂質體等多種抗腫瘤納米藥物上市，大量抗腫瘤納米藥物也已處于臨床試驗階段[5-6]。重組高密度脂蛋白（rHDL）是一種理想的藥物載體，它與人體內源性高密度脂蛋白（HDL）類似，可轉運疏水性藥物，具有良好的生物相容性和長循環特征，其表面的載脂蛋白Apo A-I可特異性識別靶細胞表面的受體SR-B1，通過內吞機制將藥物靶向投遞到特定類型的細胞[7-9]。研究者們發現SR-B1廣泛存在于多種惡性腫瘤細胞表面，包括乳腺癌、肝癌以及卵巢癌等[10-13]。

紫杉醇（PTX）是目前常用的治療胃癌的化療藥物，但臨床使用時常伴有嚴重的毒性反應，如骨髓抑制、超敏反應等[14]。本研究采用一種新型無毒制備工藝進行載紫杉醇重組高密度脂蛋白（PTX-rHDL）微球的合成，觀察其理化性質及存放穩定性，并通過細胞及動物實驗觀察其體內外抗腫瘤療效，以期為PTX-rHDL微球的臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.2 主要試劑 PTX原藥（批號：WS-20170913，江蘇紅豆杉藥業有限公司）；大豆卵磷脂（批號：160lPC-77，日本 TCI公司）；Apo A-Ⅰ（批號：GP20180563，美國Sigma公司）；NBD-PE（批號：171022，美國 Avati Polar Lipids公司）；胎牛血清（FBS，批號：160903，蘭州民海生物有限公司）；RPMI 1640培養液（批號：1900-141，美國Gibco公司）；四亞基偶氮唑藍（MTT）（批號：09052345，美國Amersco公司）；十二烷基硫酸鈉（批號：0B7103256，北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；四甲基二乙胺（TEMED）（批號：13M00163，北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；過硫酸銨（批號：0AA10211，北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（批號：DH35-3.1，北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；甲叉雙丙烯酰胺（批號：0B410295，北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；丙烯酰胺（批號：0BD109101，北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；磷脂膜染料（NBD-PE）（批號：60025，美國Biotium公司）；兔抗SR-B1抗體（批號：GR149558-14，美國NOVUS Biologicals公司）；辣根過氧化物酶HPR標記的羊抗兔IgG（批號：4413，美國Cell Signaling公司）；β-actin（批號：4970，美國Cell Signaling公司）；RIPA裂解液（批號：P0013，碧云天生物技術公司）；BCA試劑盒（批號：KGP902，南京凱基公司）；截留分子量為8 000-10 000透析袋（批號：201600307，南京大治生物科技有限公司），人胃癌細胞株MKN-45和SGC-7901（中科院上海細胞生物研究所）；乙腈（批號：PX24235D，德國 Merck公司）；鹽酸（批號：201601190，天津市大茂化學試劑廠）、無水乙醇（批號：201610530，天津市大茂化學試劑廠），水為去離子水。

1.3 實驗方法

1.3.1 PTX-rHDL微球的制備 取10mg大豆卵磷脂和1mg PTX加入2ml乙醇溶液中，攪拌5min使其完全溶解，30℃恒溫下用真空旋轉蒸發儀（型號：DZF-6092，上海一恒科學儀器有限公司）將溶劑吹干，制成均勻的脂質薄膜，干燥1h；加入0.01M磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.4）10ml，水浴超聲（型號：KH-500B，昆山禾創超聲儀器有限公司）5h，水溫持續控制在48℃以下，形成脂質懸液；加入0.05mg Apo A-Ⅰ，上述溶液以4℃保存過夜，再將該溶液置入透析袋，放置于以PBS中透析24h制備的微球4℃保存。通過透析法將合成的微球與游離PTX及大豆卵磷脂分離。空白納米粒子的制備除去不加藥物外其余過程同上。

1.3.2 PTX-rHDL微球表征觀察 （1）穩定性：制備的微球以4℃保存，在設定的時間點分別取出1ml微球，用動態光散射儀（型號：NanoBrook 90plus，美國Brookheave公司）測量粒徑的變化，評估穩定性，所有結果均測定3次。（2）載藥及包封率：PTX-rHDL載藥量和包封率由高效液相色譜（型號：1260，德國Agilent公司）測定，色譜柱為Zorbax C18 柱，流動相為乙腈/水（52/48，v/v），PTX的保留時間為5.5min，測定波長為227nm，按照中國藥典固體脂質納米包封率及載藥量公式計算。載藥率（DLC）=PTX質量/（PTX-rHDL微球質量）×100%。包封率（EE）=PTX實際質量/PTX的投料量（mg）×100%。（3）PTX-rHDL微球的粒徑和形態學通過透射電鏡（型號：JEM-2010，日本電子株式會社）和動態光散射儀觀察。

1.3.3 藥物體外釋放觀察 將6ml PTX-rHDL微球置入透析袋（截留分子量為8 000～10 000Da），透析袋完全浸沒置入 80ml PBS[含 0.5%（w/v）Tween-80]，在 37℃條件下，特定的時間點（30min 及 1、4、12、50、72、96h）取出4ml釋放介質，并替換相同體積的新的緩沖液。釋放介質中的PTX含量由高效液相色譜法分析得，每個獨立樣本重復3次。

1.3.4 不同胃癌細胞株蛋白表達檢測 采用Western blot法。人胃癌細胞株SGC-7901和MKN-45培養于含有10%FBS的1640培養液中，置于含5%CO2的37℃培養箱（型號：MCO-15AC，日本 SANYO公司），加入RIPA裂解液提取蛋白質，收集上清液后使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。經SDS-聚丙烯酰胺電泳（Mini Protean 3 Cell，美國Bio-Rad公司），轉印于NC膜，先后加入一抗及二抗，應用成像系統檢測蛋白表達（Odyssey雙色紅外熒光成像系統，美國LI-COR公司）。其中一抗采用兔抗SR-B1抗體，二抗采用辣根過氧化物酶HPR標記的羊抗兔IgG。

1.3.5 細胞攝取實驗 取10mg大豆卵磷脂溶解在2ml乙醇溶液中，加入0.01%NBD-PE，攪拌5min使其完全溶解，30℃恒溫下用真空旋轉蒸發儀將溶劑吹干制成均勻的脂質薄膜，干燥 1h。加入 0.01M PBS（pH 7.4）10ml，水浴超聲5h（水溫控制在48℃以下）形成脂質懸液，加入0.05mg Apo A-Ⅰ，上述溶液4℃保存過夜。再將該溶液置入透析袋浸入PBS中透析24h。以上操作均避光進行。將人胃癌細胞株SGC-7901和MKN-45以105密度接種在六孔板中（每孔8 000個細胞），在37℃ 5%CO2培養箱培養24h后，去除培養液，每個孔加入200μl上述熒光微球孵育4h，PBS沖洗3次后在熒光顯微鏡（型號：BX-51，日本Olympus公司）下觀察攝取情況。

1.3.6 細胞毒性實驗 采用MTT法評估PTX裸藥、rHDL、PTX-rHDL微球對SGC-7901及MKN-45細胞生長抑制作用。具體步驟為：細胞以5 000個細胞/孔的密度接種于96孔中，在37℃5%CO2培養箱中培養24h，每孔再分別加入100μl濃度為8.75μg/ml的PTX裸藥、PTX-rHDL微球、以及含有相同量大豆卵磷脂的rHDL空白微球，每個濃度設3個復孔。以加入0.9%氯化鈉溶液（NS）為對照組。與藥物作用48h后，每個孔中加入20μl 5mg/ml MTT，繼續置培養箱中培養4h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）200μl，置震蕩儀上震蕩10min充分混勻，采用酶標儀（型號：ELX800，美國Biotek公司）630nm為參考波長，檢測490nm下吸光度（OD）。細胞的存活率（%）=（各實驗組OD值/對照組OD值）×100%。樣本重復3次。

7.定期總結，將同一類型的錯題做好歸類，要學會使用標簽或符號，給相似類型的題、相關類型的題等做好標記，以便于以后分專題復習，很多學生最缺乏的就是這一步驟。其實在每周、每月、每季度、每年的定期整理歸納時，可以專門留出錯題本的前幾頁，方便后續做一個歸類整理的目錄，這樣，在翻錯題本時就不至于茫然失措了。

1.3.7 小鼠建模及分組 在小鼠右側腋下皮下注射SGC-7901細胞培養液0.5ml含2×106個細胞，使用游標卡尺測量腫瘤長短徑，按照如下公式計算腫瘤體積：V=長徑×短徑2/2。當大部分小鼠腫瘤體積達到100～300mm3，分組評估PTX-rHDL較傳統化療藥物PTX是否有更好的抗腫瘤療效，以及空白rHDL是否具有抑瘤作用及生理毒性。將荷瘤小鼠隨機分為PTX-rHDL組、PTX組、NS組、rHDL組，每組5只。分別于瘤周皮下給藥0.2ml PTX-rHDL微球（含PTX濃度為10mg/kg）、0.2ml PTX（10mg/kg）、0.2ml0.9%氯化鈉溶液、0.2m空白rHDL（空白微球濃度為100mg/kg）。每3d給藥1次，共5次。

1.3.8 體內抗腫瘤評價 在第1、4、8、11、19天測量腫瘤長短徑，并稱量小鼠體重，計算相對腫瘤體積和相對小鼠重量。相對腫瘤體積=V/V0（V是測量時腫瘤絕對體積；V0是第1天該組腫瘤平均體積）；相對小鼠體重=W/W0（W是測量時小鼠體重；W0是第1天該組小鼠平均重量）。第19天小鼠被處死，腫瘤取出稱重，并對各組小鼠的器官如心肝脾肺腎取出進行石蠟包埋后HE染色作病理檢查，評估毒性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTX-rHDL微球的合成和表征 大豆卵磷脂與PTX配比為質量比10∶1時，PTX-rHDL微球的穩定性最高，粒徑在8d內無明顯變化，見圖1。PTX-rHDL微球是直徑為（60.41±1.81）nm 球形粒子，見圖 2、3。載藥率和包封率分別為（3.86±0.90）%和（95.59±0.09）%。

圖1 不同比重大豆卵磷脂/PTX微球的穩定性

圖3 PTX-rHDL粒徑分布

2.2 PTX-rHDL微球體外釋放動力學 PTX-rHDL微球呈現先突釋后緩釋藥物的特征，在初始的4h內釋放了17.55%，在24h內共釋放了約25.00%的藥物含量，由此可以發現，載入微球的PTX具有延遲釋放的效果，見圖4。

圖4 PTX-rHDL的藥物釋放曲線

2.3 不同胃癌細胞株SR-B1蛋白表達 SR-B1蛋白在人胃癌SGC-7901細胞株高表達，在MKN-45細胞株低表達，見圖5。

圖5 MKN-45和SGC-7901的SR-B1蛋白表達的電泳圖

2.4 胃癌細胞株對PTX-rHDL微球的攝取 SR-B1表達陽性的胃癌SGC-7901細胞株攝取大量的熒光微球，而MKN-45細胞株不攝取，見圖6（插頁）。

2.5 細胞毒性試驗 SGC-7901和MKN-45細胞株的細胞毒性試驗結果見表1，SGC-7901細胞中PTX-rHDL組的細胞存活率低于PTX組、rHDL微球組及NS組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。對于MKN-45細胞中PTX組的細胞存活率低于PTX-rHDL組、rHDL微球組及NS組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。由表1可以看出：（1）對SR-B1表達陽性或者陰性細胞株的生存，rHDL無明顯影響；（2）PTX-rHDL微球對高表達SR-B1的細胞株的毒性強于低表達SR-B1的細胞株，并且比PTX裸藥殺傷作用更強。

2.6 PTX-rHDL微球的體內抗腫瘤作用 采用人胃癌細胞株SGC-7901小鼠皮下瘤模型來評價PTX-rHDL微球的體內抗腫瘤作用。在第1、4、8、11、19天測量腫瘤長短徑，根據上文公式計算相對腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。第19天時，PTX組相對腫瘤體積為6.32，NS組相對腫瘤體積為10.32，PTX-rHDL微球組相對腫瘤體積為9.14。PTX-rHDL微球組與NS組比較差異有統計學意義（P＜0.05），PTX組與NS組比較差異無統計學意義，這可能是因為本研究中使用了較小劑量的PTX以及采用間隔給藥模式，見圖7。而在小鼠體重上，PTX組、PTX-rHDL微球組與NS組比較差異均無統計學意義，見圖8。

表1 不同藥物作用于SGC-7901和MKN-45細胞株后細胞存活率（%）

圖7 4組小鼠的腫瘤體積曲線

圖8 4組小鼠體重變化曲線

所有小鼠在第19天被處死，每組的平均瘤重也被記錄并統計作為相對腫瘤體積的補充。PTX-rHDL微球組平均瘤重為（0.73±0.24）g，明顯小于NS組的（1.68±0.40）g（P＜0.05），以及 rHDL 組（1.56±0.25）g（P＜0.05）。PTX組平均瘤重為（1.46±0.32）g，低于 rHDL 組和 NS 組，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖9。小鼠瘤重結果與小鼠相對腫瘤體積結果一致。

圖9 4組小鼠瘤重比較（注：與PTX-rHDL比較，*P＜0.05）

小鼠心、肝、脾、肺、腎組織切片HE染色結果顯示，無明顯的病理變化，見圖10（插頁）。初步證實了PTX-rHDL微球的體內安全性。

3 討論

PTX作為廣譜抗癌藥物具有良好的抗腫瘤活性，但溶解度低這個特性限制了PTX的應用。rHDL在結構上、性質上與人體內源性HDL相似，具有粒徑小、生物相容性高、可與脂蛋白受體特異性結合等特點，引起研究者們的廣泛關注，rHDL可以作為良好的藥物運輸載體，搭載各類型的化療藥物、小干擾核糖核酸（siRNAs）、光敏劑和顯像劑等。

本實驗采用無毒無害的原料和方法制備了PTX-rHDL微球，形態規整，粒徑在60nm左右，具有良好的穩定性，容易保存。該大小粒徑的微球易在組織內擴散，穿透血管內皮進入腫瘤細胞。體外釋放試驗顯示所制備的微球具有長時的緩釋作用。SR-B1廣泛表達于多種惡性細胞表面，促進其增殖和轉移。通過對SR-B1蛋白不同表達的細胞株進行細胞攝取實驗，揭示該微球可以被SR-B1高表達的細胞株攝取，細胞毒性實驗中，PTX-rHDL微球對高表達SR-B1的SGC-7901殺傷作用是裸藥PTX的1.5倍，而在SR-B1不表達的MKN-45細胞株，PTX-rHDL微球對其殺傷作用小于PTX裸藥，這證實了該微球的靶向性。動物體內實驗也證實了PTX-rHDL微球可以明顯延緩腫瘤生長。研究者們發現SR-B1可以作為一個潛在的生物標志物，即不包裹任何化療藥物，也可以減緩腫瘤的生長，對腫瘤細胞有一定的殺傷作用[15]。在本研究的細胞毒性試驗中也發現rHDL組對細胞殺傷作用強于NS組，說明空白rHDL微球也有抗腫瘤趨勢，然而差異無統計學意義。PTX-rHDL微球有良好的抑瘤效果，且不良反應并無明顯增加，這符合當代惡性腫瘤的治療理念。

隨著生物化學、蛋白組學等學科的進一步發展，后續可將本實驗室腫瘤穿透肽iRGD通過化學修飾到微球表面實現雙靶向，或者聯合放療研究有無協同增效等進行更深入的探索。重組高密度脂蛋白微球作為藥物載體顯示出廣闊的應用前景，為研究者們提供新思路和新方法。