噪聲暴露對小鼠行為學和海馬區即刻早基因表達的影響

陶珊 劉秀平 卓志強

[摘要] 目的 觀察小鼠高強度噪聲短時暴露后，其行為學的改變，探索噪聲對小鼠行為和聽力的影響及機制。 方法 選取生后15 d的C57小鼠，隨機分為兩組，噪聲暴露組30只，123 dB SPL白噪聲固定時間暴露2 h;對照組30只，正常喂養，2個月后，檢測ABR反應閾，將兩組小鼠根據是否給予MWM訓練再分為兩個亞組，剝離小鼠海馬，檢測氧化應激水平，實時熒光定量PCR 法測定各組小鼠海馬組織中即刻早基因IEGs的表達水平。 結果 強噪聲單次暴露后2個月，與對照組比較，噪聲暴露組動物ABR反應閾升高，小鼠的Morris水迷宮行為表現顯著改變，差異有統計學意義（P<0.05）;兩組小鼠海馬組織中氧化應激水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。小鼠海馬組織中即刻早基因例如Npas4、Arc的表達量可通過學習與訓練來上調，但噪聲暴露組動物通過學習訓練致使兩基因上調的變化低于對照組（P<0.05）。 結論 高強度噪聲短時暴露對小鼠的行為和聽力有負性影響。學習訓練可顯著上調小鼠海馬組織中即刻早基因的表達，而噪聲暴露的作用在統計學上無顯著性差異，這可能是噪聲影響學習記憶能力的分子機制之一。

[關鍵詞] 噪聲;認知功能;氧化應激;海馬;即刻早基因

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）34-0044-04

[Abstract] Objective To observe the behavioral changes of mice exposed to high intensity noise for a short time， and to investigate the impacts of noise on behavior and hearing of mice and its mechanism. Methods C57 mice of 15 days after birth were randomly divided into the noise exposure group（n=30） and the control group（n=30）. The noise exposure group was exposed to 123 dB SPL white noise for 2 hours， while the control group was fed normally. After 2 months， the ABR response threshold was detected. The two groups of mice were divided into two subgroups according to whether they were given MWM training or not. The hippocampus of mice was stripped， and the oxidative stress level was detected. The expression level of immediate early genes（IEGs） in hippocampus of mice in each group was determined by real-time fluorescence quantitative PCR method. Results Two months after single exposure to strong noise， compared with the control group， the ABR threshold of animals in the noise exposure group was increased， and the Morris water maze behavior of mice was changed significantly， with statistically significant difference（P<0.05）. There was no significant difference in oxidative stress level between the two groups of mice（P>0.05）. The expression amount of IEGs such as Npas4 and Arc in hippocampus of mice could be up-regulated by learning and training， but the changes of up-regulation of the two genes in the noise exposure group were lower than those in the control group through learning and training（P<0.05）. Conclusion Short-term exposure to high intensity noise has negative impacts on the behavior and hearing of mice. Learning and training can significantly up-regulate the expression of IEGs in hippocampus of mice， while the effect of noise exposure has no statistically significant difference， which may be one of the molecular mechanisms of noise impacting learning and memory ability.

[Key words] Noise; Cognitive function; Oxidative stress; Hippocampus; Immediate early genes

噪聲是一種常見的有害因素，其對人體的危害不僅是聽力損失，而且對非聽覺系統也可以產生不利的影響，可導致學習記憶能力下降、免疫力下降、血壓上升等一系列的健康問題[1-2]。嬰幼兒因自身發育未成熟，更易受外界環境的影響，如病房持續的噪聲對新生兒重癥監護室里的患兒有諸多不利影響[3]。本研究通過模擬噪聲暴露環境，觀察發育早期小鼠給予噪聲暴露后，成年小鼠聽性腦干反應（Auditory brainstem response，ABR）反應閾值、行為學、氧化應激水平以及海馬組織中多種即刻早基因（Immediate early genes，IEGs）的變化情況，探索噪聲對學習記憶的影響及可能的發生機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器? RZ6聽覺電生理系統，美國;Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）系統，上海欣軟信息科技有限公司;SOD（superoxide dismutase）測定試劑盒、MDA（madondialdehyde）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;Real Time PCR儀，美國ABI公司

1.1.2 主要試劑? 戊巴比妥鈉，美國;Primer引物，上海捷瑞生物工程有限公司;Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，日本Takara公司

1.2 實驗動物及分組

本實驗選用生后15 d的C57小鼠，購于江蘇大學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK（蘇）2011-0003，飼養于東南大學醫學實驗動物中心，隨機分為兩組，即噪聲暴露組（30只）與對照組（30只）。遵循東南大學實驗動物醫學倫理委員會規定。

1.3 噪聲暴露

采用123 dB聲壓級（Sound pressure level，SPL）的白噪聲對暴露組小鼠進行固定時間暴露2 h。對照組無噪聲暴露，其他條件與暴露組相同。

1.4 實驗方法

1.4.1 聽覺功能測試? 暴露結束2個月后，通過聽性腦干反應（ABR）測定小鼠的聽力情況，具體操作：將小鼠麻醉后置于固定架上，應用美國TDT（Tucker-Davis Technology）系統Ⅲ和Biosig軟件，其中電極的連接方案及參數的設置見參考文獻[4]，ABR信號為10 ms短純音，測試頻率：2、4、8、16 kHz。測試從90 dB SPL開始，衰減間隔為5 dB，以Ⅲ波存在的最低聲強為反應閾值。

1.4.2 行為學測試? Morris水迷宮根據趙瑛等[5]文章的方式進行。將小鼠頭朝池壁放入水中，放入的位置隨機，先予60 s引導實驗，若小鼠60 s內找不到平臺，則引導小鼠至平臺，使其在平臺停留15 s。每只小鼠每天訓練4次，每次間隔時間不少于30 min，訓練5 d。第6天，撤去隱藏的平臺，將小鼠由開始的4個位置放入水中。空間記憶的檢測指標：小鼠到達平臺所花的時間;撤掉平臺后小鼠進入平臺范圍內的次數。

1.4.3 海馬組織SOD含量和MDA活力測定? 將小鼠快速處死后取海馬組織，分別制備10%組織勻漿，每組10個樣本分別測試SOD含量及MDA活力，參照南京建成生物工程研究所試劑盒進行。

1.4.4 熒光實時定量PCR（Quantitative real time-polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測? 擴增引物：Npas4（Neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4），正向5'-AGCAAGAGCCTGAGCGAAAAGA-3'， 反向5'-CTTGGTGGATCGGTACATGACTG-3';Arc（Activity-regulated cytoskeleton-associated protein），正向5'-CTCAGAGGAGTTCTTAGCCTGTTCG-3'，反向5'-ATC TCAGCTCGGCACTTACCAAT-3';β-Actin正向5'-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反向5'- GCTC GTTGCCAATAGTGATGACC-3'。PCR引物由TaKaRa寶生物工程有限公司設計，海馬組織中的總RNA由Trizol試劑提取，并及鑒定RNA樣品的濃度及純度。通過實時熒光定量PCR系統，β-Actin作為內參行實時逆轉錄PCR（qRT-PCR），計算Npas4及Arc兩者mRNA的相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS20.0統計學軟件，數據經過正態性檢驗，且全部符合正態分布，計量數據采用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗及進行單因素或雙因素ANOVA分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠ABR反應閾值比較

兩組小鼠噪聲暴露后ABR反應閾值比較，在多個頻率，噪聲暴露組小鼠ABR反應閾顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 行為學測試結果

2.2.1 隱藏平臺獲得實驗? 在前5 d訓練階段的實驗中，兩組小鼠的逃避潛伏期在第1～3天，差異無統計學意義（P>0.05）。但在第4天、第5天，兩組小鼠找到平臺的時間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2.2 空間定向實驗? 空間定向實驗中，噪聲暴露組小鼠穿越平臺次數減少，即（2.19±0.27）次，而對照組小鼠為（3.61±0.42）次，差異有統計學意義（t=3.173，P=0.005）。

2.3 兩組海馬組織SOD含量和MDA活力測定

噪聲可引起機體氧化應激反應，利用商品化試劑盒檢測了小鼠海馬組織中MDA的含量及SOD的活性。噪聲暴露組、對照組SOD含量及MDA活力見表3，兩組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4 噪聲暴露后2個月海馬中的基因表達情況比較

有訓練對照組、無訓練對照組、有訓練噪聲組、無訓練噪聲組，這四個組進行交叉比較，Npas4及Arc基因表達量的情況見表4。對噪聲暴露及訓練做雙因素方差分析，Npas4及Arc兩基因的表達水平，提示訓練的作用比較，差異有統計學意義（P<0.05），而噪聲的作用比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

隨著環境污染的加重，人們越來越關注噪聲暴露的危害。噪聲暴露不僅可以對聽覺系統產生不良的影響，而且對非聽覺系統的影響更深、更廣，可引起心率及血壓等的變化，并產生應激相關的激素，導致機體焦慮、學習記憶能力下降等[6]。

嬰幼兒因自身發育未成熟，易受外界環境的影響，如病房持續的噪聲等。研究報道新生兒重癥監護室（Neonatal intensive care unit，NICU）噪聲水平遠高于美國兒科學會推薦的NICU噪聲控制標準[7]。而噪聲對嬰幼兒可產生諸多不利影響，如心率增快、血壓上升、血氧飽和度下降、聽力損傷、睡眠障礙等，甚至可以影響新生兒神經系統的發育，導致成年期的認知困難等[8]。

中樞的聽覺通路與大腦的邊緣系統和皮層存在廣泛的神經聯系，因此噪聲暴露可引發認知相關的神經系統功能發生異常，與神經系統相關疾病具有一定的關聯性[9-10]。相關的實驗研究提示，噪聲可影響大鼠的空間學習記憶能力，其可能機制是損傷海馬的神經細胞再生功能，引起神經遞質傳導過程障礙[11]。研究顯示噪音暴露的動物空間學習記憶都會受損[12]。

研究發現，小鼠出生后第10～14天，聽力功能才開始出現，生后第14天小鼠耳蝸的功能基本成熟[13]。而此時大腦的發育尚未完成[14]。通過檢索文獻，聽覺系統發育關鍵期是出生后的早期，其發育的關鍵期會隨年齡增長消失，因此研究小鼠在出生后15 d對噪聲暴露的影響可間接提示出生早期的相關情況，在本研究中，選擇在聽覺發育關鍵期（P15）建立模型。

實驗研究顯示，聽力正常的小鼠噪聲暴露后ABR發生明顯閾移，且ABR的閾值明顯提高[15-16]。這與本實驗結果一致。本研究結果顯示，噪聲組小鼠的聽覺閾值在多個頻率均顯著高于對照組（表1），提示發育早期噪聲暴露對C57小鼠聽覺系統有不良影響。

Morris水迷宮是用來檢測空間學習及記憶能力的經典行為學實驗，具有良好的記憶量化指標[17]。前5 d的定航實驗主要檢測小鼠的學習能力，潛伏期的延長可提示空間學習能力的降低;第6天的空間測試階段測試小鼠的記憶能力。本研究Morris水迷宮試驗結果顯示，前5 d訓練階段的實驗中，兩組小鼠的潛伏期在第1、2、3天差異無統計學意義，但在第4、5天噪聲組的逃避潛伏期比對照組明顯延長，并且在第6天測試階段跨臺次數明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05），提示噪聲可影響小鼠的空間學習及記憶能力。

強噪聲暴露可致海馬組織中抗氧化酶及自由基清除劑的活性下降，使其氧化和抗氧化體系統的平衡失調，引起氧化應激反應，最終機體內產生過多的氧化應激產物及炎癥因子等[18]，超過機體的清除能力，脂質的過氧化反應將生成多余的脂質過氧化物，最終分解為丙二醛（MDA），引起海馬組織DNA損傷及蛋白質表達的異常。超氧化物歧化酶（SOD）可清除氧自由基，是機體的一道保護防線。

研究表明，持續的噪聲暴露，小鼠海馬組織中的SOD含量顯著降低，MDA含量明顯上升，提示噪聲暴露導致學習記憶能力下降的主要原因是由于海馬組織自由基代謝異常，神經系統的結構發生退變引起的[19-20]。本研究結果顯示，與對照組相比，噪聲組SOD及MDA水平差異無統計學意義，這可能是因為機體的氧化應激水平的變化是短暫的，而本研究觀察的氧化應激水平是噪聲暴露后2個月的長期效應。

外周聽覺系統的損傷可導致各級聽覺神經軸神經元的破壞，影響神經遞質的傳遞及細胞內的代謝。研究發現，海馬組織內有多種學習記憶相關聯的即刻早基因（IEGs），它們能將神經元的活性及可塑性與學習相關的基因轉導相關聯起來[21-22]。Npas4即神經元PAS結構域蛋白，可用于神經元突觸的連接部位，在神經突觸可塑性及學習記憶的形成過程中起重要作用[23]。Arc即活性調節基因，可通過腦源性神經營養因子，調節神經信號通路，促進神經突觸的可塑性[24]。研究報道，噪聲暴露或認知訓練引起海馬組織中相關IEGs表達的改變[25]。

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（收稿日期：2020-08-31）