真武湯對腎陽虛水腫大鼠模型的保護作用及對IL-17表達的影響*

崔言坤 高彥宇 高博文 楊楚琪 李 冀

（黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150000）

腎為水之臟，腎陽虛水無所制，則泛溢而為腫。腎陽虛水腫指先天稟賦不足，后天失養，或年老體衰，或久病失養以致腎陽虛衰，膀胱氣化失司，水液停留體內，臨床常表現為頭面、四肢甚至全身浮腫，小便不利或夜尿頻多，腰重足冷［1］。現代醫學對于水腫一病，主要依賴于利尿劑、白蛋白等對癥處理方案，而中醫辨證論治的特色治療手段，療效顯著。前期通過采用數據挖掘的方法，對臨床治療腎陽虛水腫選方用藥經驗進行分析，基于聚類分析基礎上選取真武湯作為實驗藥物進一步研究其作用機制。真武湯源自漢·張仲景所著之《傷寒論》，由炮附子、茯苓、白術、白芍、生姜組成，乃是溫陽化水之代表方劑，臨床應用廣泛，不僅用于腎臟疾病的治療，如腎病綜合征、糖尿病腎病、心腎綜合征等，還多用于循環系統疾病、呼吸系統疾病等一系列表現為腎陽虛的病證［2］。有研究顯示，真武湯藥理作用是通過多路徑實現的，其作用機制與調整垂體-腎上腺素軸、調節滲透壓調定點、調控細胞凋亡等都密切相關［3］。本研究通過病癥結合的模式，建立腎陽虛水腫模型，利用現代科學手段深入探討真武湯“溫陽利水”的作用及其機理，為臨床合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗采用SPF級SD大鼠，4～5周齡，體質量200～230 g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號為：SCXK（京）2019-0001。實驗動物均飼養于實驗動物中心，室溫18～24℃、相對濕度40%～50%，給予自由飲水及標準飼料，實驗期間保持晝夜節律正常。本研究獲得黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，實驗均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則，批準號：2019051001。

1.2 試藥與儀器 真武湯，組方：炮附子、茯苓、白術、芍藥、生姜按3∶3∶2∶3∶3比例稱質量（購于黑龍江中醫藥大學附屬醫院藥局）。各藥物先以10倍量蒸餾水浸泡，煎煮3次，每次1 h，減壓濃縮成生藥量1.9 g/mL的藥液，備用。氫化可的松（上海現代哈森藥業，國藥準字H41021930）；注射用鹽酸阿霉素（山西普德藥業股份有限公司，國藥準字H14023143）；鹽酸貝那普利（北京諾華制藥有限公司，國藥準字H20030514）；大鼠環磷酸腺苷（cAMP）、環磷酸鳥苷（cGMP）、醛固酮（ALD）、白細胞介素-17（IL-17）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20190725）。尿蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20191213）；低溫高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；OLYMPUS BX42電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；YT-6B組織貼片機（北京凱揚自動化科技有限公司）；RM2135石蠟組織切片機（德國LEICA公司）；Tecan infinite 200 PRO酶標儀（鄭州博賽生物工程有限責任公司）。

1.3 模型制備 大鼠適應性飼養7 d后制備腎陽虛模型。除正常組8只大鼠外，其余大鼠于第1日及第8日早8∶00通過尾靜脈注射阿霉素溶液，兩次注射劑量分別為3.5、3 mg/kg；同時，每天腹腔注射氫化可的松，注射劑量為3.75 mg/kg，連續14 d。

1.4 分組與給藥 將造模成功的大鼠24只隨機分為模型組、真武湯組、陽性藥組，每組8只。真武湯組每日灌胃1.9 g/mL真武湯藥溶液；陽性藥組灌胃1.2 mg/mL鹽酸貝那普利；其余各組灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液，連續21 d。

1.5 標本采集與檢測 1）實驗過程中，記錄大鼠行為活動，毛發狀態，進食情況，糞便情況，體質量。2）于造模后及末次給藥后，將大鼠分別置于代謝籠中，收集24 h尿液，并記錄尿量，4℃、3 500 r/min離心15 min，取上清，采用考馬斯亮藍G-250染料結合法（CBB），檢測大鼠24 h尿液尿蛋白定量，嚴格按照試劑盒說明書操作。3）末次給藥24 h后腹主動脈采血，4℃、3 500 r/min離心10 min，2次，取上清，采用全自動生化分析儀，測定血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）含量。4）采用酶聯免疫吸附法，按照試劑盒說明檢測血清中cAMP、cGMP、ALD、IL-17含量。5）免疫組化法檢測腎臟組織IL-17表達。取腎臟組織常規脫蠟、封閉，滴加IL-17抗體，4℃孵育12 h，滴加二抗，顯微鏡下DAB顯色，封片，光學顯微鏡觀察。

1.6 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀態觀察 見表1。正常組大鼠被毛光澤，反應迅速，二便正常；與正常組比較，造模后各組大鼠精神萎靡、毛發枯槁、聚堆、大便稀薄，體質量減輕，差異具有統計學意義（P＜0.01），提示造模成功；給藥第21日，與正常組比較，模型組大鼠體質量增長緩慢（P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組和陽性藥組體質量顯著增長（P＜0.01）。

表1 各組大鼠體質量比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質量比較（g，±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別正常組模型組真武湯組陽性藥組n 8 8 8 8造模第1日249.01±9.14 246.74±15.38 250.21±6.82 249.95±8.99造模第14日288.32±9.26 259.32±12.18**258.99±8.55△△262.85±10.85△△給藥第21日344.65±14.54 234.52±12.81**296.57±8.08△△281.08±18.56△△

2.2 各組大鼠24 h尿量及尿蛋白定量比較 見表2。造模后，與正常組比較，各組大鼠尿蛋白及尿量均顯著升高（P＜0.01），提示造模成功；給藥后，與模型組比較，真武湯組和陽性藥組尿蛋白及尿量均顯著下降（P＜0.01）。

表2 各組大鼠24 h尿量及尿蛋白定量比較（±s）

表2 各組大鼠24 h尿量及尿蛋白定量比較（±s）

組別正常組（n=8）模型組（n=8）真武湯組（n=8）陽性藥組（n=8）時間造模第14日給藥第21日造模第14日給藥第21日造模第14日給藥第21日造模第14日給藥第21日24 h尿量（mL）50.27±4.69 51.21±4.67 33.02±4.73**23.41±6.49**32.71±5.44**44.37±5.57△△33.57±5.66**42.49±6.61△△2 h尿蛋白（mg/dL）5.92±1.36 6.26±1.33 22.45±4.59**28.61±2.68**16.49±.191**18.65±1.90△△16.98±1.77**19.58±1.40△△

2.3 各組大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較 見表3。與正常組比較，模型組大鼠cAMP、cAMP/cGMP水平降低，cGMP水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組cAMP、cAMP/cGMP水平升高，cGMP水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較（±s）

組別正常組模型組真武湯組陽性藥組n 8 8 8 8 cAMP（nmol/L）52.69±10.23 32.41±5.13*42.35±6.04△40.19±5.55 cGMP（nmol/L）9.65±0.84 12.09±3.14 10.32±1.51 10.49±1.76 cAMP/cGMP 5.24±1.31 2.86±0.82**4.12±0.37△△3.79±0.96

2.4 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較 見表4。與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組和陽性藥組Scr、BUN含量均顯著下降（P＜0.05）。

表4 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（mmol/L，±s）

表4 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（mmol/L，±s）

組別正常組模型組真武湯組陽性藥組n 8 8 8 8 Scr 52.61±6.65 65.07±5.92*56.08±6.04△52.82±9.69△BUN 9.49±3.22 16.83±3.51**11.29±3.28△10.77±3.09△

2.5 各組大鼠血清ALD、IL-17含量比較 見表5。與正常組比較，模型組大鼠ALD、IL-17含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組和陽性藥組ALD、IL-17含量均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠血清ALD、IL-17含量比較（±s）

表5 各組大鼠血清ALD、IL-17含量比較（±s）

組 別n ALD（mL/kg）IL-17（ng/L）正常組模型組真武湯組陽性藥組8 8 8 8 234.52±62.56 446.14±80.51**303.72±65.76△274.16±60.61△△14.34±2.66 30.67±5.86**16.26±3.67△△17.26±4.41△△

2.6 各組大鼠腎臟IL-17表達比較 見圖1。結果顯示，正常組腎臟組織中有少量IL-17表達，多集中在腎小管；與正常組比較，模型組IL-17在腎小管上表達顯著，腎小球有少量表達，呈深棕色；與模型組比較，真武湯組和陽性藥組IL-17表達明顯降低，弱陽性表達，呈淺棕色。

圖1 各組大鼠腎臟IL-17表達（DAB染色，400倍）

3 討 論

近年來，隨著中醫藥在許多疾病的治療上顯示出其獨特的優勢，利用現代藥理學手段建立中醫病癥結合模型，已經成為科研的必要方式。本實驗選取氫化可的松聯合阿霉素方式，通過腹腔注射氫化可的松干預下丘腦-垂體-靶腺軸模擬傳統中醫病因學復制大鼠腎陽虛模型［4］，同時尾靜脈注射阿霉素誘導腎源性水腫，從而建立大鼠腎陽虛水腫模型［5］。阿霉素及其代謝產物可直接損傷足細胞，導致濾過膜的分子屏障受損而引發蛋白尿，其具有的腎毒性會進一步促使炎性細胞分泌，破壞腎小管上皮細胞，從而引起水腫病癥［6］。氫化可的松可抑制促腎上腺皮質激素分泌，使下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）反饋受到抑制，當外來皮質激素突然撤退，則暴露出HPA軸的抑制狀態，繼而表現出一系列陽虛癥狀，且其所具有的腎毒性，會進一步加重腎臟水腫［7］。

腎陽虛則機體失于溫煦，陰寒內生，氣化功能失調，表現出一系列癥狀，如神疲乏力，四肢不溫，大便稀溏等構建腎陽虛模型需要確保其符合臨床實際［8］。本實驗結果表明，造模后各組大鼠均表現出一定程度的倦怠少動，不欲飲食，體質量下降，被毛枯槁，便溏，符合腎陽虛證。cAMP與cGMP是一對相互拮抗又制約的物質，共同參與細胞的調控，這與中醫學“陰陽學說”相對應［9］。研究報道，陽虛時表現為cAMP含量降低，cGMP含量升高，cAMP/cGMP降低，因此通常將cAMP、cGMP含量作為腎陽虛模型的考察指標之一［9］。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統廣泛存在于人體組織中，在體液調節中起到關鍵作用，ALD是其重要的活性因子之一［10］。ALD是人類主要的鹽皮質激素之一，在腎臟疾病中可作為獨立危險因素，是調節機體水鹽代謝的基礎，作用于遠端小管，具有排鈉保鉀作用，同時在受體活化介導下具有促纖維化和促炎的作用［11］；有研究報道，ALD水平與水腫呈正相關，可能與其通過激活鹽皮質激素受體，損傷大鼠足細胞和腎小管上皮細胞發生自噬相關［12］。蛋白尿是水腫的重要指標，腎功能也與其緊密相關，Scr和BUN是常用的腎功能檢測指標，二者血清水平變化反映了腎小球濾過率的改變。IL-17是TH17細胞重要效應分子之一，由多種免疫細胞分泌，可誘導促炎因子的表達而加重炎癥反應，損傷靶器官，研究證實，IL-17與腎臟疾病的發生發展關系密切，可直接誘導腎臟足細胞的凋亡，且與蛋白尿水平呈正相關［13］。

真武湯是溫陽利水之代表方劑，《古今名醫方論》謂真武湯“真武一方，為北方行水而設”［14］。方中附子為君，走腎溫經，峻補元陽；茯苓甘淡滲濕，益脾助陽，白術甘苦而溫，燥濕實脾，二者共為臣藥；生姜辛溫，既助附子化氣，又可助苓、術溫中健脾；芍藥酸斂，既防附子傷陰，又緩急止痛，并取其利小便行水之功，全方諸藥相配，共奏溫陽利水之功。本實驗結果顯示，與模型組比較，真武湯組大鼠一般情況得到改善，體質量顯著增長，cAMP、cAMP/cGMP水平顯著升高，cGMP水平顯著降低，說明真武湯顯著改善了陽虛癥狀；尿蛋白、BUN、Scr顯著降低，尿量顯著升高，提示真武湯能有效改善腎功能；同時，血清ALD、IL-17顯著升高，腎臟組織IL-17表達增強。

綜上，真武湯對腎陽虛水腫有治療作用，通過改善腎臟功能，調劑HPG軸達到利尿消腫的功效，其機制可能與抑制IL-17介導的足細胞凋亡有關。本研究為進一步拆分真武湯有效組分配伍奠定了基礎。