電刺激對脊髓損傷大鼠神經再生及NRG-1/ErbB-PI3K/Akt通路的影響*

王 倩 朱 薇

（1.空軍軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710033；2.西北大學附屬第一醫院，陜西 西安 710002）

脊髓損傷可導致原發性機械損傷、繼發性神經細胞凋亡、反應性神經膠質增生和軸突無法再生。由于受損脊髓的無反應環境，不會發生軸突再生［1-2］。脊髓損傷后功能的喪失可能來自主要的機械損傷和隨后的多方面的二次退行性反應［3］。近年來，研究證明受損的脊髓功能可以恢復。電刺激被用作促進神經系統損傷和疾病后功能恢復的治療工具。電刺激的臨床應用的實例包括用于恢復聽力的耳蝸植入物，用于恢復呼吸和手掌握的下運動神經元的刺激，以及用于治療帕金森病癥狀的深部腦刺激［4］。電刺激也被用于抵消與麻痹相關的失用性萎縮。電刺激在脊髓損傷患者的臨床環境中已得到應用。研究脊髓損傷患者電刺激的實際益處包括：肌肉質量增加、骨密度改善、心血管功能增強、改善腸功能、減少痙攣、膀胱感染率降低。神經調節蛋白（NRG1）是ErbB受體的配體家族，其可明顯刺激中樞神經系統培養細胞生長能力［5］。NRG1在多種內皮細胞中高表達，包括：培養的人臍靜脈內皮、人冠狀動脈和心內膜內皮，以及來自成年大鼠心室的冠狀微血管內皮。研究證實，NRG1在脊髓神經元中高表達，NRG1與ErbB的結合誘導其自身及其共同受體ErbB的磷酸化［6-8］。NRG1/ErbB信號通路在神經信號通路信號傳導中發揮重要作用，調節神經細胞功能，包括抗凋亡和血管生成反應。既往研究表明NRG1過表達對培養的神經細胞具有PI3K/Akt依賴保護作用［9］。本研究擬探討電刺激對脊髓損傷大鼠神經再生及NRG1-ErbB-PI3KAkt通路的影響，探討脊髓損傷的分子機制，為脊髓損傷的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，12周齡，體質量（200±20）g，空軍軍醫大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（陜）2017-0005。動物使用許可證號：SYXK（陜）2018-0012。

1.2 試劑及儀器 TrizolTM試劑（美國Invitrogen公司，批號69874）；TaqManTMmiRNAs Assay試劑盒（美國Applied Biosystems公司，批號32417）；RNeasy Mini Kit試劑盒（德國Qiagen公司，批號ab4063）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒（寶日醫生物技術（北京）有限公司，批號180326）；Ultra SensitiveTMS-P試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，180128）；NRG1、ErbB、PI3K、Akt一抗（1∶100，武漢博士德生物工程有限公司，批號：604315、602317、602346、607125）；二氨基聯苯胺（DAB）、蘇木精溶液（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號30625、30419）。XE-98 MEP儀器（美國Axon公司）；安捷倫Mx3000P實時熒光定量PCR儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；組織冷凍培養基（美國熱電公司）；CM1850低溫恒溫器（德國徠卡）；振蕩電場刺激器（中國科學院電氣工程研究所）。

1.3 模型制備 將大鼠隨機分成3組：對照組、模型組、電刺激組，每組20只。模型組、電刺激組測量大鼠的初始體質量，然后腹膜內注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g體質量）麻醉大鼠，用膠帶將每只大鼠的四肢和頭部固定在手術臺上，然后用3%碘溶液對皮膚進行消毒。在T10棘突的中心沿著背部的中線進行縱向切口，長度約為2 cm，然后將組織層切開以顯示T9～T11薄層和棘突，用微型剪刀切割 T9～T11棘突，小心地提起T10椎板以避免撕裂肋骨并損傷血管，隨后暴露T10脊髓，然后將大鼠固定在大鼠脊髓減重裝置上，通過使10 g金屬棒從5 cm的高度自由落到大鼠的脊髓上誘導脊髓損傷，當大鼠的脊髓被擊中時，大鼠的尾巴或后腿抽搐。誘導脊髓損傷后，電刺激組振蕩電場刺激器的兩個電極用不可吸收的縫合線固定在T9和T12棘突的兩側，然后逐步移除切口縫合線，術后每日腹腔注射100 000單位的青霉素，連續3 d，以防止感染。誘導脊髓損傷大鼠每天被動排尿2～3次，直到建立自動排尿，在被動排尿時，用左手抬起腹部，用右手搜尋填充的膀胱，一旦定位，膀胱從底部被擠壓，直到尿液逐漸排出，會陰部保持干燥以防止感染。

1.4 干預方法 術后第3天使用振蕩電場刺激器對電刺激組給予電刺激治療，振蕩電場刺激器設置參數為：強度為40 μA，脊髓上的電場強度為400 μV/mm，振蕩周期的持續時間為15 min。每日1次，連續7周。

1.5 機械痛閾（PWT）及熱刺激潛伏期（PWTL）的測定 各組大鼠處死前，將大鼠置于透明觀測盒里，用秒表計時，從大鼠后足與托盤接觸到出現踮腳、回縮、舔足、掙扎記為大鼠的熱刺激縮足反射潛伏期，測定PWT、PWTL［10］。

1.6 脊髓損傷的行為學評分（BBB）及運動誘發電位（MEP）的測定 BBB評級是評估脊髓損傷大鼠運動功能最常用的評估方法之一，分為21個等級。它還用于觀察后肢活動，包括后肢每個關節活動的數量和范圍，支撐身體的能力，以及前肢和后肢之間的協調。此外，它可以分為早期運動強度，中期協調，晚期精細活動。在BBB評級完成后，將所有組中的大鼠麻醉，然后通過使用MEP儀器檢測MEP，將兩對刺激針電極放置在T7/8和L1/2椎板之間的間隙附近，正電極指向前部，負電極指向后部。兩個電極之間的距離范圍為0.5～0.8 cm，設定以下參數：脈沖寬度0.05 ms，輸出強度100～150 V。然后將電極置于腓腸肌的兩側，記錄復合肌肉動作電位作為最終值。

1.7 脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達水平的測定 用Trizol試劑從脊髓中分離總RNA，使用Taqman miRNA逆轉錄試劑盒逆轉錄，并使用Taq-ManTMmiRNAs Assay試劑盒進行實時PCR，重復實驗3次。將NRG1、ErbB、PI3K。kt表達標準化為U6，重復實驗3次，使用RNeasy Mini Kit試劑盒從脊髓組織分離的總RNA用隨機六聚體和Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行逆轉錄。NRG1、ErbB、PI3K、Akt引物如下：NRG1 正向：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，反向：5′-TCACGCCACAGTTTCCC GGA-3′。ErbB 正向：5′-ATTCGTAGAGGATTGACG-3′，反向：5′-AACTGCTACAGTTTTCCGTAT-3′。PI3K正向 ：5′-CCTAGGACTTGCTTA-3′，反 向 ：5′-CCTAAGCACAGTCCTGACTG-3′。Akt正 向 ：5′-CGTAGCTACTCCTGGGA-3′，反 向 ：5′-CCTGACTGACACAGT CCTGGGACCT-3′。U6 正向：5′-CGCCTAGTCCTGGG AATGA-3′，反向 ：5′-CCTAGTAGGTACACAGTCCTGGCCTGAGA-3′。熱循環：1個循環，94℃，3 min；30個循環，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，68 ℃ 90 s；然后是72 ℃10 min。獲得 Ct值，并使用 2-ΔΔCt的方法計算相對表達，根據下式進行計算：ΔCt（靶基因）=Ct（靶基因）-Ct（參考基因）。

1.8 脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達水平的測定 試驗結束后，通過腹膜內注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露胸部，用0.9%氯化鈉注射液連續灌注肝臟的頂點直至顏色變白。將組織用4%多聚甲醛灌注30 min并在4%甲醛中固定12 h后，取出位于末端附近1 cm處的受損脊髓和脊髓組織，然后將切片包埋在最佳冷卻溫度組織冷凍培養基中，通過低溫恒溫器將冷凍切片橫向切片，厚度為10 μM。待定免疫組織化學超敏性Ultra SensitiveTMS-P試劑盒制備FFPE組織切片。在二甲苯中脫蠟并在一系列分級醇中再水合，將切片熱固定并阻斷過氧化物酶活性，與蛋白質封閉溶液一起溫育。隨后將切片與針對NRG1、ErbB、PI3K、Akt的抗人兔Mobility抗體一起溫育，接著與二抗溫育。二氨基聯苯胺（DAB）用作色原體，切片用蘇木精溶液復染，脫水并固定，使用雙盲法評估所有載玻片，對于每個切片，選擇5個高倍視野（400倍）并在每個視野中計數100個細胞，將染色強度和陽性面積百分比組合以解釋FOXP3和TLR4免疫組織化學反應性；如下，染色強度：0=無染色，1=灰色，2=黃色，3=棕色；陽性區域：0表示≤5%，1表示 6%～25%，2表示26%～50%，3表示51%～75%，4表示＞75%。將染色強度和陽性面積的值相乘以得到最終得分，0～2的評分為陰性，3～4為弱陽性，6～8為中度陽性，9～12為強陽性。

1.9 統計學處理 應用SPSS23.0對數據進行錄入、統計學分析。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠PWT、PWTL、BBB、MEP潛伏期評分比較 見表1。與對照組比較，模型組PWT、PWTL、BBB評分水平降低，MEP潛伏期升高（P＜0.05）；與模型組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分升高，MEP潛伏期降低（P＜0.05）；與對照組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分水平略微降低，MEP潛伏期略微升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠PWT、PWTL、MEP潛伏期及BBB評分比較（±s）

表1 各組大鼠PWT、PWTL、MEP潛伏期及BBB評分比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組 別n PWT（g）PWTL（S）BBB評分（分）MEP潛伏期（ms）對照組模型組電刺激組20 20 20 36.14±6.12 12.65±6.36*35.32±5.19△21.34±3.45 7.86±2.98*20.77±3.34△20.13±3.95 8.54±2.39*18.54±2.69△6.24±1.36 52.36±6.85*7.00±3.24△

2.2 各組大鼠脊髓神經結構的比較 見圖1。對照組脊髓神經結構正常、脊髓神經元細胞完整；模型組脊髓中心灰質區見小片狀被破壞，白質內大量體積小囊泡形成，呈蟲蝕樣改變；電刺激組白質內大量體積小囊泡數目減少，脊髓神經結構趨于正常，小片狀被破壞面積減少。

圖1 各組大鼠脊髓神經結構（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達水平比較 見表2。與對照組比較，模型組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與對照組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達水平略微降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達水平比較（±s）

組別對照組模型組電刺激組n 20 20 20 NRG1 mRNA 1.79±0.13 0.85±0.14*1.58±0.13△ErbB mRNA 2.15±0.18 1.54±0.13*1.98±0.13△PI3K mRNA 1.76±0.17 0.98±0.12*1.58±0.17△Akt mRNA 1.94±0.11 0.56±0.13*1.73±0.18△

2.4 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達水平比較 見表3，圖2～圖5。與對照組比較，模型組NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與對照組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達水平略微降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。免疫組化法下，NRG1、ErbB、PI3K、Akt陽性表達為棕褐色，NRG1、ErbB、PI3K、Akt陽性表達情況與各蛋白表達水平符合。

表3 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

表3 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

組別對照組模型組電刺激組n 20 20 20 NRG1 236.54±14.63 86.65±19.96*200.63±16.98△ErbB 187.96±16.65 103.65±19.96*169.65±17.63△PI3K 183.67±15.63 71.14±16.78*180.73±13.65△Akt 145.77±6.46 67.86±6.98*143.45±6.98△

圖2 各組大鼠脊髓區NRG1蛋白表達（DAB染色，400倍）

圖3 各組大鼠脊髓區ErbB蛋白表達（DAB染色，400倍）

圖4 電刺激對大鼠脊髓區PI3K蛋白表達水平（DAB染色，400倍）

圖5 各組大鼠脊髓區Akt蛋白表達（DAB染色，400倍）

3 討 論

電刺激對脊髓損傷患者有益，失去下肢功能的脊髓損傷患者由于動態能力有限，可能會出現明顯的肌肉萎縮和一般健康狀況下降，通過神經肌肉電刺激，這些個體的癱瘓肢體可以被誘導產生運動和力量，電刺激可增強脊髓損傷患者站立、劃船、踩踏、伸展和行走的能力。越來越多的證據表明，電刺激可以促進損傷后的外周和中樞神經系統修復［11］。在大鼠股神經橫斷和修復的模型中，電刺激促進運動神經元的腦源性神經營養因子（BDNF）釋放并增強穿過遠端神經殘端的優先運動神經再支配，這種刺激范例也促進了股神經修復后的功能恢復［12-13］。本研究結果顯示，模型組PWT、PWTL、BBB評分水平降低，MEP潛伏期升高；與模型組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分升高，MEP潛伏期降低；與對照組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分水平略微降低，MEP潛伏期略微升高。這與上述研究結果符合，同時提示電刺激能減輕大鼠脊髓損傷程度，促進損傷神經再生。結合損傷脊髓病理結果，對照組脊髓神經結構正常、脊髓神經元細胞完整；模型組脊髓中心灰質區見小片狀被破壞，白質內大量體積小囊泡形成，呈蟲蝕樣改變；電刺激組白質內大量體積小囊泡數目減少，脊髓神經結構趨于正常，小片狀被破壞面積減少。這提示電刺激能恢復受損脊髓結構，減輕脊髓損傷。

NRG1是一種特定的生長因子，其在軸突表面表達，與ErbB受體酪氨酸激酶結合由施萬細胞表達，并作為髓鞘形成的觸發分子，因此，NRG1/ErbB信號傳導的強度決定施萬細胞是否產生髓鞘以及產生多少髓鞘［14-15］。由于少突膠質細胞也對NRG1有反應，因此在神經系統中少突膠質細胞介導的髓鞘形成過程中可能存在這種NRG1/ErbB信號傳導機制，NRG1通過與ErbB3或ErbB4結合而發揮作用；然后，每種受體與ErbB2異二聚體化，ErbB2不能直接結合NRG1，但具有活性激酶結構域。施萬細胞主要表達ErbB2和ErbB3，但少突膠質細胞以發育調節的方式表達所有3種ErbB受體［16-18］。已顯示該信號傳導在髓鞘形成過程中調節髓鞘形成的施萬細胞的形態和基因表達。在神經系統中，NRG1/ErbB信號傳導涉及廣泛的過程，包括神經元遷移，軸突尋路和突觸可塑性。體外研究表明［19］，這種信號傳導影響少突膠質細胞的表達，分化，髓鞘形成和存活。研究表明［20］，PI3K/AKT通路激活通過調節抗凋亡和自噬反應在脊髓損傷中起著重要的神經保護作用。Akt磷酸化可削弱神經細胞凋亡相關下游分子的表達，如裂解的Caspase-3、6、9，Bcl-2和Bax，導致Bcl-2/Beclin-1復合物的解離，該過程釋放Beclin-1并導致自噬反應。PI3K激酶抑制劑LY294002可阻斷了自噬體形成，PI3K/AKT途徑的激活可抑制脊髓損傷后的細胞凋亡。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白表達水平降低；電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白表達水平較模型組升高，同時與對照組比較無明顯差異。這提示電刺激可促進NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白的表達誘導脊髓損傷大鼠神經再生。

綜上所述，電刺激能減輕大鼠脊髓損傷程度，促進損傷神經再生；其機制與電刺激激活NRG1-ErbBPI3KAkt通路，促進 NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白的表達有關。