狹葉黃芩組織培養再生體系的建立

張 靜 牛 喆 范衛芳 高鵬飛 吳建慧

(東北林業大學園林學院，哈爾濱 150040)

東北地區地理環境特殊，能夠在東北露地越冬的植物種類較少。狹葉黃芩(Scutellariaregeliana)是唇形科(Labiatae)黃芩屬(Scutellaria)多年生草本植物，自然分布在東北地區，是一種優良的野生觀賞植物，可作為地被植物在園林中應用。近幾年這類野生植物逐漸進入城市園林應用，是園林綠化的優良材料之一，具有很高的觀賞價值。黃芩屬的植物生長緩慢，在自然生長條件下遠不能滿足市場的需求。其雖以種子繁殖為主，但在干旱及其他不良環境下，出苗率難以控制在較高的水平；扦插繁殖易受扦插季節和插條部位等因素的影響；而分根繁殖則繁殖系數低；不利于大面積的應用[1]。

近年來，關于黃芩屬植物組織培養技術的報道已有一些。日本學者最早在LS培養基上接種黃芩(Scutellariabaicalensis)節段，并得到了淡褐色的愈傷組織[2]。國內學者在進行誘導黃芩愈傷組織試驗研究時，成功誘導出黃芩愈傷組織[3]。以黃芩的子葉、真葉和下胚軸為外植體，吳曉玲等[4]對黃芩組織培養誘導條件進行試驗研究，并確定了褐化率為0，誘導率高達100%的培養基。李富雄等[5]利用組培技術進行黃芩同源四倍體誘導，為將來選育有用成分含量高的優良品種打下基礎。以帶腋芽的粘毛黃芩(Scutellariaviscidula)幼莖為外植體，王淑芳等[6]通過對植物激素配比及使用濃度的比較選擇，建立出一套高效的粘毛黃芩的組培快繁體系。薛欣等[7]通過試驗進行黃芩無菌材料的培養并且優化黃芩快繁技術，確定黃芩繼代和快繁的最佳方法是采用單節培養。韓淑蘭等[8]研究發現結果與其大致相同。近年來狹葉黃芩因其花色美麗，具有較高的觀賞價值在園林中逐漸開始應用，但狹葉黃芩以種子繁殖的方法耗時較長，短時間內無法滿足應用，同時也未見關于狹葉黃芩組培方向的報道，所以本研究以黃芩屬中的狹葉黃芩莖段作為外植體，篩選出適合各階段的培養基配方，建立其組培快繁體系。為有效實現黃芩屬資源的開發利用和保護提供一定能夠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自黑龍江省森林植物園的野生狹葉黃芩，2017年9月栽植到100 mm×90 mm的花盆中，將其放在植物培養室中進行緩苗，給予正常的水分和光照管理，待植株恢復生長后，選取其當年生帶節莖段作為供試材料進行試驗。所用培養基每1 L均添加蔗糖25 g、瓊脂7.5～7.8 g、pH值調為5.8～6.0。培養室溫度為(25±1)℃，空氣相對濕度保持在50%～60%，光照強度為2 000 lx，光周期為16 h·d-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的處理與消毒

于晴朗的上午剪取健壯且無病害的當年生枝條的嫩莖，將莖段表面清洗干凈，然后將莖段剪成1～2 cm的長度，使用洗潔精對莖段進行清洗，清洗3 min后流水下沖洗30 min。于超凈工作臺中無菌水清洗3遍，75%酒精清洗15 s后再用無菌水沖洗3～5遍，然后在0.1%的HgCl2或者1% NaClO溶液中浸泡3、5、8、11 min進行消毒，最后使用無菌水沖洗5遍。然后將莖段接種于MS培養基上。每處理接種30個莖段，每瓶接種一個，3次重復。20 d后統計不同消毒時間的污染率、褐化率和存活率。

1.2.2 莖段腋芽的誘導

1.2.3 莖段愈傷組織的誘導

將消毒處理后的狹葉黃芩的莖段接種于愈傷組織誘導培養基上，添加6-BA(0.5、1、2 mg·L-1)，2-4D(0.5、1 mg·L-1)、NAA(0.05、0.1、0.2、0.5 mg·L-1)和TDZ(0.05、0.1 mg·L-1)的組合。以期篩選出莖段最適誘導愈傷的激素配比組合。每處理接種30個外植體，3次重復。30 d后統計愈傷組織誘導率并記錄生長狀況。

1.2.4 愈傷組織不定芽的分化

以MS為基本培養基作為狹葉黃芩愈傷組織分化培養基，添加6-BA(0.5、1、2 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1)誘導愈傷組織塊進行分化。每種處理30個愈傷組織塊，3次重復。30 d后觀察統計不定芽分化率及平均不定芽數。

1.2.5 腋芽的增殖培養

腋芽增殖培養基和上述9種誘導腋芽的培養基組合相同。后期愈傷組織分化而來的不定芽增殖培養也使用此培養基。比較兩種激素組合對芽增殖的差別影響。每種處理30個外植體，3次重復。30 d后統計增殖芽數，計算增殖倍數。

1.2.6 腋芽生根的誘導

根據系統需求,濾波器性能指標如表1所示,可以看到系統對濾波器的遠端抑制(≥25 dB@5.95～10 GHz)要求較高。

將生長健壯，高度為2～3 cm的具有2對新葉的不定芽接種到生根培養基上，以1/2MS為基本培養基，添加不同濃度的NAA(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)或IBA(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)組合，以期取得最適宜的生根效果。每個處理30瓶，每瓶1株，重復3次，定期觀察狹葉黃芩生根情況并記錄生長狀況。接種20 d后統計生根率、平均生根數、平均根長。

1.2.7 組培苗的煉苗與移栽

為提高組培苗的成活率并使其能在自然環境下正常生長，需在移栽前進行煉苗處理。將高度為4～5 cm并且根長超過2 cm的試管苗打開瓶蓋，倒入清水。將開蓋后的組培苗在組培架上1 d，再移到室溫條件下放2 d，取出后用蒸餾水小心沖洗根上殘留的培養基。然后把沖洗干凈的生根組培苗移栽到基質中，放置在背陰處3d后轉入植物培養室，在此期間給予正常的水分和光照管理。30 d后統計移栽成活率及幼苗生長情況。

1.3 數據統計與分析方法

采用SPSS22.0統計軟件進行方差分析和顯著性分析，采用Excel 2007計算測定數據和圖表制作，數據均為3次重復試驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 莖段不同消毒方法的篩選

由表1可知，消毒時間分別為3、5、8、11 min時，使用兩種消毒劑處理的褐化率均為0，即無論采用哪種消毒方法，外植體都沒有褐化現象。1% NaClO在消毒處理時間為5 min時效果最好，污染率最低為13.05%，存活率最高為86.95%，與1% NaClO處理的其他時間差異顯著(P<0.05)。0.1%的HgCl2消毒處理最佳時間也是5 min，其污染率最低為8.25%，存活率為91.75%，與0.1%的HgCl2消毒處理的3、11 min差異顯著。狹葉黃芩莖段消毒最好的方法是0.1%的HgCl2消毒5 min。

2.2 莖段腋芽的誘導

將狹葉黃芩莖段接種到腋芽誘導的培養基上，一周后腋芽開始萌發。由表2可知，當6-BA濃度為0.5 mg·L-1時，腋芽誘導率和平均腋芽數隨著NAA濃度的升高而逐漸降低，但變化趨勢并不顯著，說明此時NAA濃度的變化對于腋芽的生長變化不大。當NAA濃度分別為1、2 mg·L-1時，隨著6-BA濃度的升高，腋芽誘導率和平均腋芽數也隨之升高。在所有處理組中，8號處理組腋芽誘導率最高為79.12%，平均腋芽數也最高為1.49個，但此時外植體生長較慢。當6-BA濃度較低(0.5 mg·L-1)或較高(2 mg·L-1)時，植物生長狀況不良，表現為葉片泛黃，生長變慢。而在6-BA濃度為1 mg·L-1時，植物生長良好(圖1A)。確定最適宜狹葉黃芩莖段腋芽萌發的培養基為MS+1 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA。

表1 不同消毒方法對狹葉黃芩莖段消毒效果的影響

Table 1 Effect of different disinfection methods on disinfection effect forS.regelianastem segments

消毒劑Disinfectant消毒時間Disinfection time(min)污染率Pollution rate(%)褐化率Browning rate(%)存活率Survival rate(%)HgCl2319.35±5.59b0±0a80.65±5.59b58.25±1.89c0±0a91.75±1.89a89.68±0.31c0±0a90.32±0.31a1121.42±3.09ab0±0a78.58±3.09bcNaClO325.81±3.23a0±0a74.19±3.23c513.05±1.39c0±0a86.95±1.39a822.58±3.23ab0±0a77.42±3.23bc1118.44±3.02b0±0a81.56±3.02b

注：表中每列的值是平均值±標準差；同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05)；下表同。

Note:Values represent as Mean±SE;After the same column data, different lower-case letters showed significant difference at 0.05 level(P<0.05);The same as below.

表2 不同激素配比對狹葉黃芩莖段誘導腋芽的影響

表3 不同激素配比對狹葉黃芩愈傷組織誘導率的影響

2.3 莖段愈傷組織的誘導

由表3的數據可知，在只含有6-BA和2-4D的培養基中，4號處理組的誘導率最高為91.33%，與2、3、6號均有顯著差異(P<0.05)，此時的愈傷綠色、疏松、芽點較多(圖1B)。在添加6-BA、2-4D和NAA的各處理組中，愈傷的誘導率均在80%以上，但此時的愈傷生長表現為白色致密，不利于愈傷的后期分化。而在添加TDZ和NAA的培養基上，在TDZ濃度不變時，愈傷誘導率隨著NAA濃度的升高而逐漸降低，且各處理組的愈傷生長狀態不良，甚至有褐化和水樣化的現象發生。確定狹葉黃芩誘導愈傷的最佳培養基為MS+1 mg·L-16-BA+1 mg·L-12-4D。

2.4 莖段愈傷組織的分化

將愈傷組織接種到分化培養基上，由表4可以看出，在6-BA濃度為0.5 mg·L-1，分化率最高的是3號處理組，其分化率為20.17%，與其他各組差異顯著(P<0.05)。在6-BA濃度為1 mg·L-1，分化率最高的是7號處理組，其分化率為44.71%，與其他各組差異顯著(圖1C)。在NAA濃度為1 mg·L-1，愈傷組織的分化率隨著6-BA濃度的升高而增加，且與其他各組差異顯著。其中褐化率最低的是5號處理組為11.6%，最高的是10號處理組為28.56%，平均不定芽數最多的是6.33個，為7號處理組。確定愈傷組織分化的最佳培養基為MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。

2.5 腋芽的增殖培養

將狹葉黃芩莖段誘導而來的腋芽接種到增殖培養基上，10天后叢生芽開始萌發。由表5可知，不同處理組間增殖倍數差異顯著(P<0.05)。1號處理組的增殖倍數最低為1.3，4號處理組的增殖倍數最高為5.859(圖1D)，當6-BA濃度分別為1、2 mg·L-1時，芽增殖倍數隨著NAA濃度的升高而降低且差異顯著。當6-BA濃度較高(2 mg·L-1)時，新芽雖然多但葉片變黃。確定芽增殖的最佳培養基為MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。

2.6 腋芽生根的誘導

不定芽的高度達到1～2 cm時將外植體轉入生根培養基中。以1/2MS培養基為基本培養基，在培養7天后逐漸有新根產生。由表6可以看出，在只添加IBA的處理組中，隨著IBA濃度的增加，其生根率整體呈下降趨勢，其中IBA濃度為0.2 mg·L-1時生根率最高為74.07%，且與其他各組差異顯著(0.1 mg·L-1除外)(圖1E,F)。在只添加NAA的各處理組中，9號處理組生根率最高為45.98%，且與其他各處理組差異顯著(P<0.05)。當IBA或NAA濃度高于0.3 mg·L-1時對生根率、平均生根數、平均根長產生了一定的不良影響，表現為抑制植物根的生長。在所有的處理組中，8號處理組的平均生根數最高為17.69個，4號處理組的平均根長最長為3.61 cm。確定莖段生根的最佳培養基為1/2MS+0.2 mg·L-1IBA。

表4 不同激素配比對狹葉黃芩愈傷組織分化影響

表5 不同激素配比對狹葉黃芩芽增殖的影響

表6 不同激素配比對狹葉黃芩不定芽生根的影響

圖1 狹葉黃芩帶芽莖段再生體系的各培養階段 A.莖段誘導腋芽；B.莖段誘導愈傷組織；C.愈傷組織分化不定芽；D.帶芽莖段增殖；E.生根3 d；F.生根15 d；G.組培苗移栽7 d；H.組培苗移栽30 dFig.1 Different culture phases of budded stem regeneration system of S.regeliana A. Stem segment induces axillary buds; B. Callus induced by stem segments; C. Callus differentiation adventitious bud; D. Proliferation of shoot segments with buds; E. Rooting for 3 d; F. Rooting for 15 d; G. Tissue culture seedlings were transplanted for 7 d; H. Tissue culture seedlings were transplanted for 30 d

2.7 煉苗和移栽

蛭石、珍珠巖，園土的比例不同，對狹葉黃芩移栽成活率有顯著的影響。由表7可知，栽植到三種基質下，植物的生長狀況均為良好，但移栽成活率差異顯著(P<0.05)，其中3號即蛭石∶珍珠巖∶園土=1∶1∶3時，移栽成活率最高為79.24%(圖1G,H)。

表7 不同移栽基質對狹葉黃芩移栽成活率的影響

Table 7 Effect of different medium on bud induction forS.regeliana

處理號Processing number移栽成活率Survival rate of transplantation(%)生長狀況Growth status174.31±3.76b植株健壯,生長良好The plants are strong and grow well260.33±4.51c植株健壯,生長良好The plants are strong and grow well379.24±6.17a植株健壯,生長良好The plants are strong and grow well

3 討論

外植體的表面滅菌是組培中防治污染至關重要的一步[9]。對消毒劑要求易沖洗、易分解，清除微生物又不影響植物材料生長。不同植物不同部位的外植體對消毒劑的敏感程度不同[10]。因此消毒劑的種類、濃度和時間的選擇至關重要[11]。過長過短的消毒時間都不利于植物生長，恰當的消毒時間能提高存活率。在植物組織培養過程中，常用的消毒劑有NaClO，H2O2、HgCl2、AgNO3等。本研究選擇1% NaClO和0.1% HgCl2作為消毒劑，發現狹葉黃芩莖段最適宜的消毒方法為0.1% HgCl2消毒5 min。

組織培養中，外植體直接誘導芽是較快捷的方式。本研究表明，狹葉黃芩莖段在2種激素組合上都誘導出腋芽，但平均腋芽數、腋芽誘導率以及芽生長狀況均有差異。并且同時使用6-BA與NAA誘導腋芽的影響效果顯著，誘導率隨著6-BA濃度的升高而升高，隨著NAA濃度的升高呈先升高后下降趨勢。植物激素是培養基中的關鍵物質，用量雖少但對愈傷組織的誘導和分化起著重要的調節作用[12～13]。在一定范圍內，植物激素濃度升高，對植物的促進作用增強，超過這一范圍濃度再升高，就會抑制植物生長[14]。同時多種激素協同作用效果要遠大于一種激素單獨使用效果[15]。

其作用效果與外植體及愈傷組織本身內源激素的種類和濃度有重要關系[16]。有研究發現2-4D，KT，NAA等植物激素配比使用有利于外植體愈傷組織的形成，且NAA濃度越高，形成的愈傷組織質地越好[17]。但在本試驗中，在添加6-BA、2-4D和NAA的組合中，狹葉黃芩莖段誘導而來的愈傷組織質地堅硬，不利于后期分化培養，這與前人的研究結果不一致。在添加TDZ和NAA的組合中，愈傷組織有褐化和水樣化的趨勢，而張璐[18]等對宜昌百合的研究中發現，誘導愈傷組織的3種激素中，作用關系最大的是TDZ，其次是2-4D，最后是NAA。在含有6-BA和2-4D的培養基中，愈傷生長良好，愈傷組織的誘導率也最高為91.33%，而賀美忠對黃芩的研究中發現，當使用1 mg·L-1的6-BA和0.5 mg·L-1NAA時愈傷組織的誘導率達到最大值[1]。愈傷組織分化階段，在NAA濃度為1 mg·L-1，愈傷組織的分化率隨著6-BA濃度的升高而增加。所有處理組中褐化率最低的為11.6%，平均不定芽數最多的是6.33個。在6-BA濃度為1 mg·L-1，NAA濃度為0.5 mg·L-1時分化率最高為44.71%。建立狹葉黃芩組織培養快繁體系，實現狹葉黃芩的資源保護與開發利用，仍需要進一步篩選基本培養基、激素、添加物等因素。

研究發現不定芽增殖培養時將6-BA和NAA配合使用，芽苗增殖系數大且生長勢強[19]。本試驗中激素組合MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，不定芽增殖系數是所有配比中最大的，這說明適宜的植物生長調節劑濃度可以產生較高的增殖系數。高山林[3]等人在黃芩組培體系優化的研究中發現，使用PP333和6-BA時黃芩愈傷組織分化出的叢生芽最多，分化率為100%，這一研究結果可為后續研究優化狹葉黃芩的組培體系提供參考。組培苗生根能力的強弱和根系的生長狀況直接決定了植株移栽的成活率。組培苗具有強大的根系與生根能力，才能更好的吸收利用土壤中的有效養分[20～21]。有研究認為生長素NAA和IBA對無菌苗生根均有促進作用[22]，生長素IBA常用于組培苗不定根的誘導[20,23]，在狹葉黃芩試管苗生根試驗中，本研究在1/2MS基本培養基的基礎上添加不同濃度的IBA和NAA，試驗結果發現添加IBA的激素組合整體比添加NAA的生根效果較好，IBA濃度為0.2 mg·L-1時，生根效果最佳，隨著IBA濃度的升高，生根率下降，說明濃度較高的IBA對根的誘導有抑制作用。王淑芳[6]等人在研究粘毛黃芩的生根培養基時發現，IBA濃度為0.5 mg·L-1時生根效果最好，比狹葉黃芩所需要的濃度要高，這就說明在相同濃度IBA下，狹葉黃芩比粘毛黃芩生根較容易。植物在移栽時根長應適宜，一般為2 cm，根長過長影響煉苗，過短影響水分吸收，不利于成活[24]。本試驗中狹葉黃芩經煉苗后在三種基質中生長均健壯，但移栽成活率差異顯著，其中蛭石∶珍珠巖∶園土=1∶1∶3時，移栽成活率最高為79.24%，并且此時園土占比最多，最為經濟。