R2R3型MYB轉錄因子HbMYB88結構和功能分析

樊松樂 王紀坤 謝貴水 王 萌 王立豐*

(1.海南大學熱帶作物學院，海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口 570228； 2.農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室；省部共建國家重點實驗室培育基地——海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室；農業農村部儋州熱帶作物科學觀測實驗站；中國熱帶農業科學院橡膠研究所，海口 571101)

MYB轉錄因子(MYB TFs)是一個龐大且功能多樣的家族，在所有真核生物中都有表達[1]。MYB蛋白具有高度保守的DNA結合結構域，由4個不完全氨基酸重復序列(R)組成，R大約有52個氨基酸，形成3個α螺旋，第二和第三螺旋構成具有三個規則間隔的色氨酸或疏水殘基的螺旋轉角螺旋(HTH)結構，在三維HTH結構中形成疏水核心[2]。MYB蛋白家族可分為R1/R2-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB、4R-MYB四類[3]。R2R3-MYB轉錄因子DNA結合結構域(MYB結構域)位于N端，激活或抑制結構域位于C端。相對于高度保守的MYB結構域，R2R3-MYB蛋白的其他區域具有高度的可變性[4]。研究表明R2R3-MYB TFs參與植物生長發育、代謝過程，特別是對各種生物和非生物脅迫的反應，并參與激素合成和信號轉導[1]。目前，在擬南芥已經鑒定出126個R2R3-MYB家族成員、水稻鑒定出109個R2R3-MYB家族成員且功能研究相對比較深入。如，AtMYB125/DUO1是一種花粉特異性轉錄因子，控制花粉雄性生殖細胞分裂分化[5]。R2R3-MYB轉錄因子HAG1/MYB28是擬南芥中蛋氨酸衍生硫代葡萄糖酸鹽生物合成的調控因子[6]。AtMYB44與擬南芥對綠桃蚜和小菜蛾抗性有關，可通過激活擬南芥中EIN2介導的防御系統調節其抗性[7]。AtMYB60和AtMYB96分別通過ABA信號級聯作用調控氣孔運動[8]，干旱脅迫[9]和抗病性[10]。AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113參與花青素的生物合成[11～12]。AtMYB77和ARF7相互作用參與擬南芥生長素的信號轉導[3,13]。AtMYB124和AtMYB88屬于R2R3-MYB家族成員，AtMYB124和AtMYB88參與了擬南芥氣孔細胞系的后期分裂過程及擬南芥根的向地性生長，氣孔對植物適應非生物脅迫至關重要[14～15]。

我國屬非傳統植膠區，橡膠樹在生長發育過程中會遭受到許多環境因子的影響，如低溫、干旱[16]等。相對于R2R3-MYB家族成員在模式植物的生長發育、初級代謝和次級代謝、生物脅迫和非生物脅迫功能研究進展，橡膠樹中MYB家族轉錄因子相關的結構與功能研究較少[17～18]。陸燕茜等對HbMYB62轉錄因子進行了表達模式分析，研究表明其與橡膠樹抗逆反應和激素信號傳導有關系并預測了在橡膠樹中的生物學功能[19]。劉彤等實驗發現HbMYB20在橡膠樹的木質部相對表達量最高，利用該基因在擬南芥過表達分析其功能，推測HbMYB20負調控橡膠樹的次生壁發育[20]。Peng等通過HbMYB20過表達轉基因煙草植株，推測在橡膠樹中該基因能抑制脅迫反應誘導細胞死亡[17]。Dubos等2010年將擬南芥R2R3-MYB家族分成25個亞族，然而AtMYB124和AtMYB88尚未劃分亞族，研究表明AtMYB124和AtMYB88參與了擬南芥氣孔細胞后期分裂過程及擬南芥根的向地性生長，氣孔細胞及根生長均與干旱等逆境均有關系[1,14～15]。AtMYB124、AtMYB88與R2R3-MYB家族的S25亞族親緣關系最近，S25亞族成員包括AtMYB119、AtMYB64、AtMYB118、AtMYB115、AtMYB100和AtMYB22。Rabiger等研究表明MYB64和MYB119是擬南芥雌性配子發生過程中細胞化和分化所必需的[21]。過表達PGA37/MYB118和MYB115可促進擬南芥胚性獲得[22]。轉錄因子MYB115參與調控原花青素生物合成，增強楊樹的抗真菌能力[23]。為了揭示R2R3-MYB家族成員在橡膠樹中扮演的角色及生物學功能及為將來劃分亞族提供參考，本研究克隆HbMYB88的cDNA基因全長并測序得到該基因序列，系統進化分析其與擬南芥AtMYB88親緣關系最近，將其命名為HbMYB88，利用生物信息學分析預測該基因及其推導的氨基酸序列的結構和特性，并利用熒光定量PCR分析該基因的表達模式，為闡明HbMYB88在橡膠樹的生物學功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以中國熱帶農業科學院橡膠研究所國家橡膠樹種質資源圃Reyan73397健康10年樹齡正常割膠橡膠樹的根、莖、葉、花、膠乳和樹皮為材料，用于HbMYB88的克隆和不同組織的表達分析。用0.05%(v/v)的乙醇水溶液來溶解配置200 μmol·L-1脫落酸(abscisic acid，ABA)、1.0%(v/v)乙烯利(Ethephon，ETH)和2%(v/v)過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)，葉面噴施法處理Reyan73397品種株高為70～80 cm的組培苗，對照組用0.05%(v/v)的乙醇水溶液，取樣時間分別為0、0.5、2、6、10、24、48和72 h。干旱處理參照我們以前的方法[16]。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取總RNA和cDNA的合成

參照TIANGEN植物總RNA提取試劑盒的方法，提取巴西橡膠樹不同組織和不同處理樣品的總RNA，RNA濃度與純度通過Thermo Fisher NanoDrop 2000超微量核酸蛋白分析儀(Gene Company Limited，上海)檢測。利用TaKaRa反轉錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板利用PCR擴增內參基因HbACTIN，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反轉錄得到的cDNA。

1.2.2 克隆HbMYB88 cDNA的基因全長

根據橡膠樹數據庫的序列設計引物(表1)，以Reyan73397正常葉片的cDNA為模板，利用PCR擴增HbMYB88的全長序列，OMEGA膠回收試劑盒并參考使用說明對PCR產物進行回收，連接pMD-18T載體后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中，在含氨芐抗性培養基上培養，檢測后挑取陽性克隆送賽默飛世爾公司測序。

表1HbMYB88全長擴增和熒光定量引物序列

Table 1 Primer sequences of full-length cloning and qRT-PCR ofHbMYB88

引物名稱Primer name引物序列Primer Sequence(5′—3′)HbMYB88FAATAAAGGAGGGAGCGTCAAHbMYB88RAACACCCGAAACCAAATCHbMYB88QFCAGCAAGCCCACAATGACACHbMYB88QRTGCTTGGATTGGGACAAGGAHbACTINFGATGTGGATATCAGGAAGGAHbACTINRCATACTGCTTGGAGCAAGA

1.2.3 HbMYB88生物信息學分析

利用在線工具SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、DeepLoc-1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/)、PSIPRED V4.0(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)、SMART:Main page(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線分析軟件對HbMYB88進行生物信息學預測分析。DNAMAN7軟件進行多序列比對及分析同源相似性。Geneious 4.8.4軟件使用鄰接法(neighbor-joining)進行系統發育分析(bootstrap值設為1 000)。系統進化分析所選用的蛋白序列均來自NCBI。

1.2.4 不同處理下HbMYB88表達分析

根據HbMYB88編碼蛋白序列設計熒光定量引物(表1)，選用橡膠樹HbACTIN基因為內參，采用SYBR Green法在伯樂熒光定量PCR儀軟件進行定量PCR檢測，熒光定量PCR反應體系和程序參考前人方法[19]。

1.2.5 數據統計分析

采用Excel進行數據整理分析，IBM SPSS Statistics進行單因素ANOVA檢驗分析差異顯著性，Origin Pro2016(Origin Lab Corporation，Massachusetts，USA)軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 HbMYB88的克隆與生物信息學分析

以橡膠樹葉片cDNA為模板，通過PCR克隆得到HbMYB88 cDNA全長，測序驗證和比對，將cDNA序列命名為HbMYB88(GenBank:MG427051.1)。其長度1 848 bp，包含1 440 bp的ORF，HbMYB88基因編碼區的核苷酸和推導的氨基酸序列，共編碼479個氨基酸殘基(圖1)。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)工具在線分析蛋白質的理化性質：分子式為C2362H3732N690O752S14、相對分子質量為54 276.63 kDa、等電點為6.90、不穩定系數為62.99、總平均親水性為-0.802。通過在線分析工具SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析預測HbMYB88存在信號肽的概率是0.002 1，TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析預測HbMYB88無跨膜蛋白結構，利用在線分析工具DeepLoc-1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/)預測HbMYB 88蛋白亞細胞定位，發現定位于細胞核中的概率為0.999 1，定位于細胞質的概率為0.000 8(圖2)。利用在線分析工具PSIPRED V4.0(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測HbMYB88蛋白的二級結構(圖3A)發現存在許多螺旋和卷曲結構，利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線分析工具分析其三級結構發現存在HTH結構與二級結構預測結果相符合(圖3B)。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)分析HbMYB88的保守結構域可知存在兩個SANT結構域和一個low complexity，其位置分別在21-70、73-121和411-420氨基酸處，HbMYB88氨基酸序列具有植物MYB轉錄因子家族的特異性結構域SANT-myb DNA結合結構域，屬于R2R3-MYB家族(圖3C)。

圖1 HbMYB88基因編碼區的核苷酸序列和推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HbMYB88 coding region

圖2 HbMYB88亞細胞定位預測Fig.2 Prediction of subcellular localization of HbMYB88

圖3 HbMYB88結構分析 A.HbMYB88二級結構預測；B.HbMYB88三級結構預測；C.HbMYB88保守結構域預測Fig.3 Structural analysis of HbMYB88 A.Prediction for the secondary structure of HbMYB88; B.Prediction for the tertiary structure of HbMYB88; C.Prediction of the conserved domains of HbMYB88

圖5 橡膠樹HbMYB88蛋白與擬南芥中126 R2R3-MYB家族成員蛋白序列的系統樹聚類分析Fig.5 Phylogenetic tree of HbMYB88 from rubber tree and 126 R2R3-MYB protein members from Arabidopsis with indicated GenBank accession numbers

圖6 HbMYB88基因在組織、干旱、脫落酸，過氧化氫和乙烯利處理葉片的表達分析 各柱形圖上用不同小寫字母標識表示數據間差異極顯著(P<0.05)，各柱形圖上用不同大寫字母標識表示數據間差異極顯著(P<0.01)。Fig.6 HbMYB88 expression in different tissues and leaves treated with drought，ABA，H2O2 and Ethylene Different lowercase letters above each column means significant at P<0.05 level,and different uppercase letters above each column means significant at P<0.01 level.

從圖4可以看出，HbMYB88與木薯MeMYB124(Manihotesculenta,XP_021613500.1)、麻風樹JcMYB124(Jatrophacurcas,XP_012067595.1)、榴蓮DzMYB88(Duriozibethinus,XP_022733260.1)、綠豆VrMYB88(Vignaradiata,XP_014492598.1)、樹棉GaMYB51(Gossypiumarboretum,XP_017632310.1)進行同源性分析，相似性分別為89.98%，85.18%，70.52%，64.75%和71.01%，與木薯MeMYB124相似性最高。將它們進行多序列比對并根據SMART:Main page工具分析HbMYB88的結果，標注其保守結構域SANT與low complexity結構(圖4A)。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線分析軟件分析橡膠樹HbMYB88與其他植物MYB蛋白序列排名前三的motif(圖4B)且標注了其在相關序列的位置，橡膠樹HbMYB88基序a(10-56)、b(57-106)主要分布在SANT保守區域，基序c位置在424-473氨基酸處，motif序列與生物功能密切相關。在模式植物擬南芥(R2R3-MYB家族成員)中與AtMYB88親緣關系最近(圖5)。

2.2 HbMYB88的表達分析

通過分析實時熒光定量PCR數據發現，HbMYB88在橡膠樹根、莖、樹皮、葉片、膠乳中均有表達量，其中在莖和花的表達量較高，莖的表達量是根的21倍左右，但在根、樹皮、葉片和膠乳中HbMYB88的表達量相對較低(圖6)。在干旱處理條件下，葉片中HbMYB88基因的表達量在1 d上升，3 d顯著性上升且達到最高點，之后表達量下調相對處理之前呈下調趨勢。在ABA噴施處理后，葉片中HbMYB88基因的表達量在0～10 h顯著性上調且在10 h達到最高點，之后下調恢復到處理前的水平。葉片經過H2O2處理，HbMYB88基因的表達量在0～2 h無顯著性變化，在2 h后開始顯著性上調，10 h時基因表達量達到最大值，隨后下調，相比較處理前呈上調趨勢。ETH處理后葉片中HbMYB88基因的表達量在0～10 h整體呈現上調的趨勢并在10 h達到峰值，隨后急劇下調并趨于穩定。

3 討論

MYB TFs在植物生長發育、非生物脅迫和防御反應中起著重要作用[24]，MYB蛋白在植物中的功能包括調控次生代謝、調控細胞形態發生、調控分生組織形成和細胞周期[25]。R2R3-MYB蛋白是植物中最大的轉錄因子家族之一，參與植物細胞、組織形態的發生、初級代謝、次級代謝過程，還與生物脅迫和非生物脅迫有關，并在激素合成和信號轉導中發揮作用[4]。

本研究從橡膠樹葉片克隆得到HbMYB88基因并測序得到該基因序列，利用生物信息學分析其推導的氨基酸序列發現屬于R2R3-MYB家族并具有HTH結構。HbMYB88與MeMYB124、JcMYB124、DzMYB88、VrMYB88、GaMYB51蛋白序列的相似性分別為89.98%，85.18%，70.52%，64.75%，71.01%。在擬南芥中與AtMYB88屬于同一分支，親緣關系最近。

Legay等研究發現桉樹R2R3-MYB家族轉錄因子EgMYB1負調控擬南芥、楊樹次生細胞壁的形成[26]。楊樹MYB家族轉錄因子PtrMYB3、PtrMYB20、MYB189參與調控次生壁生物合成[27～29]。Cho等研究表明在小黑楊和擬南芥中過表達毛果楊R2R3-MYB家族轉錄因子PtrMYB119可促進花青素積累[30]。Fang研究表明在擬南芥中過表達楊樹R2R3-MYB家族轉錄因子PtrSSR1提高了其鹽脅迫耐受性，鹽脅迫耐受的提高與擬南芥LRE和ABA信號的調控相關[31]。Peng等研究發現麻風樹轉錄因子JcMYB2參與生長調控、發育和脅迫耐受[32]。Ruan等轉錄組分析預測299個木薯MeMYB基因，其中150個基因屬于R2R3-MYB家族，利用RNA干擾技術(RNAi)獲得MeMYB2-RNAi突變體木薯，R2R3-MYB家族轉錄因子MeMYB2沉默可提高轉基因木薯的干旱和冷脅迫耐受性[33]。AtMYB124(FLP)和AtMYB88在非生物脅迫反應和雌性生殖發育過程中發揮作用[34～35]。Xie等研究發現，與野生型相比，flp-1myb88雙突變擬南芥植株更易受到干旱和鹽脅迫的影響，全基因組表達分析表明，在正常生長條件下，脅迫反應基因如WRKY40、ERF6、ZAT10、ZAT12、DREB2A在flp-1myb88雙突變體中下調[34]。推測HbMYB88可能參與橡膠樹抗旱等逆境反應及雌性生殖發育過程。通過qRT-PCR可知，HbMYB88在橡膠樹根、莖、樹皮、葉片和膠乳中均有所表達，在莖中表達量最高，除了在莖和花中，在其他組織中相對表達量極低。根據HbMYB88基因在各個組織中的表達程度，表明其在莖中比在其他組織中發揮著更重要的作用。在不同激素處理中，ABA和H2O2處理后HbMYB88基因顯著上調10 h時達到最高，為處理前的10倍左右。ABA、H2O2和ETH處理后整體呈上調趨勢且均在10 h達到最高點，之后下調。ABA是植物逆境激素，與多種逆境響應相關，在植物受到脅迫時能快速積累[36]。ABA在植物生長發育中具有廣泛的功能，但其主要功能是調節植物的水分平衡和滲透脅迫耐受[37]。圖6可知在干旱及乙烯利處理下HbMYB88最高相對表達量1.4倍左右，然而在ABA處理下其最高相對表達量10倍左右，推測HbMYB88可能屬于依賴ABA途徑的轉錄因子，通過結合相應的順式作用元件進而調控下游干旱相關基因的表達。H2O2涉及植物細胞防御基因表達調控相關的多種信號通路，調控植物的生長發育、參與氣孔運動等。植物體內形成了復雜、有效的氧化應激機制以減輕和防止H2O2的毒害進而維持ROS平衡。AtMYB124和AtMYB88參與了擬南芥氣孔細胞的后期分裂過程[14]。ABA是H2O2合成過程中的一個重要信號分子，通過與其他植物激素的相互作用來抑制MAPK級聯[38]。在干旱脅迫下，鈣依賴蛋白激酶(CPK8)通過CAT3(CPK8相互作用蛋白)參與了ABA介導的氣孔調控。cpk8和cat3植株的CAT活性降低，H2O2積累增加[39]。H2O2參與ETH等植物生長調節劑的信號傳遞[40]。ABA和H2O2處理下HbMYB88最高相對表達量大約都是10倍左右而干旱脅迫下僅為1.4倍左右(圖6)，因此推測HbMYB88和干旱脅迫無直接關系，HbMYB88通過其他途徑間接調控干旱等逆境，HbMYB88可能依賴ABA途徑調控干旱等逆境響應。

本研究通過生物信息學預測分析基因的相關信息和熒光定量PCR技術分析了HbMYB88在不同組織和不同激素處理下的表達情況，發現HbMYB88與橡膠樹抗旱等逆境響應有關，為進一步闡明其結構和功能打下基礎。