紅花爾基樟子松優(yōu)良抗旱菌樹組合的篩選

趙 敏 郝文穎 寧心哲 郝龍飛 閆海霞 牟亞男 白淑蘭*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，呼和浩特 010019； 2.呼倫貝爾市林業(yè)科學(xué)研究所；海拉爾 021008； 3.呼和浩特市環(huán)境監(jiān)測中心站，呼和浩特 010030)

為了保證生態(tài)系統(tǒng)的良好功能，樹木根系和外生菌根真菌(ectomycorrhizal fungi，ECMF)的互惠互利作用是必不可少的[1～2]。外生菌根能改善宿主植物的營養(yǎng)和水分狀況，改良土壤結(jié)構(gòu)，提高植物的生長速率和根系功能[3]，增強植物的抗逆性[4]。尤其在干旱退化生態(tài)系統(tǒng)中表現(xiàn)更為突出，ECMF在長期的進化過程中形成了對干旱脅迫的耐受性，并作用于植物，增強植物對干旱環(huán)境的生態(tài)適應(yīng)性和可塑性[5]，從而提高植物的抗旱能力，使植物更好地存活[6]。

紅花爾基林區(qū)屬于寒溫帶大陸性干旱氣候，該區(qū)森林茂密、物種豐富，形成了特殊的沙地樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)群落及生態(tài)系統(tǒng)，是我國北方重要的生態(tài)屏障[7]，這里被譽為樟子松的故鄉(xiāng)，也是國家定點的三北防護林種子基地之一。但近幾年來該區(qū)降雨量驟減，出現(xiàn)了樟子松大面積死亡現(xiàn)象。2016年本研究團隊在出菇盛期對紅花爾基樟子松林內(nèi)ECMF資源進行調(diào)查時并沒有采到一株ECMF。所以，我們分析在極度干旱的環(huán)境中，ECMF資源也在不斷枯竭。眾所周知，樟子松是典型的菌根依賴性樹種[8]，那么如何提高樟子松在日益干旱環(huán)境中的生存能力是生產(chǎn)實踐中亟待解決的問題。因此，本研究在實驗室條件下通過對樟子松幼苗接種5種ECMF，并分別測定其在非干旱脅迫和干旱脅迫條件下各項生理生化指標(biāo)，試圖篩選出樟子松優(yōu)良抗旱菌樹組合，最終為樟子松菌根化苗木的定向培育以及樟子松逆境造林提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究供試樟子松種子采自于紅花爾基健壯的樟子松林中(47°36′～48°35′N，118°58′～120°32′E)。供試菌種均采自于紅花爾基樟子松林地內(nèi)，選擇5個優(yōu)勢菌株通過子實體組織分離獲得菌種，菌種保存于4℃冰箱中(表1)。

表1 供試菌種名錄

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗培育

挑選飽滿成熟的樟子松種子，在溫水中浸泡12 h，再用2%高錳酸鉀消毒30 min，用蒸餾水沖洗4～5次后放入已經(jīng)滅菌的鋪有兩層濕吸水紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫催芽。育苗基質(zhì)為經(jīng)過高溫高壓(0.1 MPa，121.0℃，40 min)蒸汽滅菌的蛭石、泥炭、林地土及沙土(各基質(zhì)體積比為1∶1∶1∶1)。育苗盆用3%的H2O2進行消毒，然后放入滅菌基質(zhì)，選發(fā)芽一致、健壯的芽苗播入其中，然后置于光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 菌劑制備

采用MMN培養(yǎng)基制備固體菌劑。按配方配制適量的營養(yǎng)液[9]，再與蛭石混拌均勻，水分含量70%，然后裝入玻璃瓶進行高溫高壓滅菌(0.1 MPa，110℃，40 min)。冷卻后放入超凈工作臺內(nèi)接入生長健壯的平板菌，最后于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在培養(yǎng)45 d后各菌種菌絲長滿瓶，黃褐口蘑的菌絲呈白色微黃，其他4個菌種菌絲均呈純白色。

1.2.3 幼苗的接種與培養(yǎng)

試驗選用內(nèi)徑15 cm，高12 cm規(guī)格的育苗盆，先在育苗盆底放入適量的滅菌基質(zhì)，然后每盆放入15 g生長良好的菌劑，再將長勢均勻的5個月齡樟子松盆栽苗栽入其中，每盆栽3株，盡量使幼苗根部與菌劑密切接觸，以利于菌根的形成。然后覆土，使盆與基質(zhì)總重量合計1 000 g。同時，設(shè)一對照處理，即將5種固體菌劑等量混合再經(jīng)高溫高壓滅菌，冷卻后將15 g接入同樣規(guī)格的苗木，其他方法同上。即試驗共設(shè)5個接種處理，1個對照處理，6個處理均設(shè)60個重復(fù)，然后置于光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)(光照強度為16800 lx，光照時間為12 h·d-1，溫度為25℃)。在苗木培育階段，每兩周澆一次10% Hogland營養(yǎng)液，每盆澆150 mL。

1.2.4 幼苗的干旱脅迫處理

接種8個月后，每個處理隨機抽取5株幼苗進行菌根形態(tài)觀察和菌根侵染率的統(tǒng)計，菌根形態(tài)采用解剖鏡進行觀察，菌根侵染率利用劃線交叉法進行統(tǒng)計。然后結(jié)合苗木生長狀況進行間苗，最終每盆只保留1株健壯苗木，各處理分別選擇長勢基本一致的50株對其進行非干旱脅迫和干旱脅迫處理，各25株。非干旱脅迫處理通過稱重補水法在處理期間每天補充水分，保持含水量(65±5)%；干旱脅迫處理在培育8個月后開始停止?jié)菜M自然干旱脅迫。當(dāng)某個處理幼苗的第一枚針葉出現(xiàn)萎蔫時(含水量為19.1%)，隨機抽取兩種水分條件下各處理苗木進行各指標(biāo)的測定。

1.2.5 苗木生長及生理生化指標(biāo)的測定

每個處理非干旱脅迫與干旱脅迫分別抽取5株幼苗，用直尺測定苗高，將幼苗沖洗干凈后，沿幼苗莖基部剪斷，將地上部分和地下部分分別裝入容器內(nèi)，然后置于80℃烘箱內(nèi)烘至質(zhì)量恒定，分別測定地上、地下生物量，并計算根莖比。然后每個處理分別抽取10株幼苗采用鄰本三酚自氧化法測定針葉超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，愈創(chuàng)木酚法測定針葉過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，硫代巴比妥酸法測定針葉丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量[10]。

1.2.6 針葉萎蔫時間及臨界致死時間的測定

分別選擇各處理10株干旱脅迫苗木進行針葉萎蔫時間及臨界致死時間的測定。在干旱脅迫過程中，每6 h觀察記錄一次各處理針葉變化特征，當(dāng)發(fā)現(xiàn)各處理的第一枚針葉出現(xiàn)萎蔫時即確定為萎蔫時間；并且持續(xù)觀察記錄各處理苗木在干旱脅迫條件下完全死亡的時間即確定為臨界致死時間。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理及分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010進行統(tǒng)計；為了評估接種處理、水分處理，以及接種處理和水分處理的相互作用對樟子松幼苗各項指標(biāo)的影響，利用SPSS 20.0軟件對這些數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和雙因素方差分析，LSD多重比較檢驗顯著性差異；然后使用OriginPro 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理樟子松幼苗菌根侵染率與菌根形態(tài)

通過菌根侵染率統(tǒng)計、形態(tài)觀察及分叉形狀統(tǒng)計(表2)發(fā)現(xiàn)，5種ECMF均能與樟子松形成菌根，且菌根侵染率由大到小的趨勢為：S.b>R.l>S.l>S.s>T.f，且S.b、R.l、S.l、S.s、T.f各處理的侵染率分別為80.0%、74.2%、72.4%、65.0%、37.4%；對照未形成菌根。此外，S.b與樟子松形成的菌根有棒狀、二叉狀和羽狀，其中二叉狀約占70%，棒狀約占20%，羽狀約占10%；R.l與樟子松形成的菌根呈棒狀和二叉狀，主要為二叉狀，約占90%；S.l與樟子松形成的菌根為二叉狀和棒狀，各約占50%；S.s與樟子松形成的菌根以棒狀為主，約占90%，二叉狀約占10%；T.f與樟子松形成的菌根基本為棒狀。而對照沒有形成菌根，幼苗根系細(xì)長，粗細(xì)均勻，有明顯的根冠和根毛。各菌種與樟子松根系形成的菌根形態(tài)如圖1所示。

表2 各供試菌株對樟子松菌根侵染率及所形成菌根的分叉特征統(tǒng)計

Table 2 Statistics of mycorrhizal infection rate and bifurcation characteristic of mycorrhizal formation ofPinussylvestrisvar.mongolicaby various test strains

處理Treatment菌根侵染率Mycorrhizal infection rate(%)分叉形狀占比The proportion of mycorrhizal bifurcation shape(%)二叉狀Dichotomous棒狀Rodlike羽狀PinnateS.b80.0702010R.l74.29010—S.l72.45050—S.s65.01090—T.f37.4—100—CK0.0———

注：“—”表示未發(fā)現(xiàn)這樣的菌根形態(tài)。

Notes:“—” indicates that no such mycorrhizal morphology was found.

圖1 不同處理樟子松幼苗菌根形態(tài)Fig.1 Different treatments of mycorrhizal morphology of P.sylvestris var. mongolica

表3 不同水分處理對各處理樟子松幼苗生長的影響

注：表中同一列不同字母表示P<0.05差異顯著。

Notes:Different letters in the same column indicate significant differences inP<0.05.

2.2 不同水分條件對各處理幼苗生長的影響

在兩種水分條件下，接種處理的苗高、地上生物量與地下生物量均顯著高于未接種處理(P<0.05)。在干旱脅迫條件下，R.l處理的地上和地下生物量較未接種處理分別增加120.1%和260.5%，S.l處理分別增加了72%和176.5%，S.b處理分別增加了154.2%和398.8%，S.s處理分別增加了41.1%和112.3%，T.f處理分別增加了43.9%和101.2%。

與非干旱脅迫相比，干旱脅迫條件下，各處理苗高與地上生物量差異不顯著；而地下生物量有明顯的變化，除T.f處理外，其余各接種處理的地下生物量均顯著增加(P<0.05)，增加幅度大小順序為：S.b(27.0%)>R.l(20.7%)>S.l(17.9%)>S.s(17.0%)；各接種處理的根莖比均顯著增加(P<0.05)，增加幅度大小順序為：S.b(25.8%)>R.l(19.2%)>S.l(15.1%)>S.s(14.0%)>T.f(12.8%)，但對照處理的這些生長指標(biāo)較非干旱脅迫均下降(表3)。說明在干旱脅迫下，外生菌根對苗木地下生物量的積累表現(xiàn)出比非干旱脅迫條件下更明顯的優(yōu)勢。根莖比是壯苗的重要標(biāo)志，干旱脅迫下，菌根化苗木通過提高地下生物量促使形成發(fā)達(dá)根系來抵御干旱脅迫。因此，S.b對樟子松苗木的促生效果最好。

經(jīng)雙因素方差分析(表4)可知，接種處理對樟子松幼苗地上和地下生物量均產(chǎn)生極顯著影響(P<0.001)；而水分處理對其地下生物量發(fā)揮顯著作用(P<0.05)，但對其地上生物量并沒有顯著影響；接種處理和水分處理的交互作用對樟子松幼苗地下生物量產(chǎn)生極顯著影響(P<0.001)，而地上生物量在兩者之間無顯著的交互作用。

表4 接種處理與水分處理對樟子松生物量的雙因素方差分析結(jié)果

Table 4 The results of two-way ANOVA of biomass ofP.sylvestrisvar.mongolicaby inoculation treatment and water treatment

處理Treatment地上生物量Above-ground biomass地下生物量Under-ground biomass接種處理Inoculation treatment(IT)??????水分處理Water treatment(WT)NS?接種處理×水分處理IT×WTNS???

注：*.P<0.05差異顯著；***.表示P<0.001差異極顯著；NS.不顯著

Note:*.P<0.05 is significant; ***.P<0.001 is extremely significant; NS. Not significant

2.3 不同水分對各處理樟子松幼苗SOD、POD活性和MDA含量的影響

在非干旱脅迫條件下，所有處理SOD活性無顯著差異(圖2)。在干旱脅迫條件下，所有處理SOD活性均顯著升高，且接種處理SOD活性均顯著高于未接種處理(P<0.05)；同時，S.b處理SOD活性顯著高于其他接種處理。與非干旱脅迫相比，干旱脅迫條件下，R.l、S.l、S.b、S.s和T.f處理分別升高了44.5%、42.5%、50.8%、39.7%和38.7%；而未接種處理僅升高了23.7%，升高的幅度顯著低于接種處理。

圖2 不同水分條件對各處理樟子松幼苗SOD的影響柱狀圖中不同小寫字母表示菌種間的差異顯著性(P<0.05)；*表示相同接種處理下，非干旱脅迫與干旱脅迫條件的差異顯著性(P<0.05) 下同。Fig.2 Effect of different water condition on the activity of SOD enzyme of P.sylvestris var. mongolica in each treatment Different lowercase letters in the histogram indicate significant differences among strains(P<0.05); * indicates the significant difference between non-drought stress and drought stress conditions under the same inoculation treatment(P<0.05).The same as below.

圖3 不同水分條件對各處理樟子松幼苗POD活性的影響Fig.3 Effect of different water condition on the activity of POD enzyme of P.sylvestris var. mongolica in each treatment

圖4 不同水分條件對各處理樟子松幼苗MDA含量的影響Fig.4 Effect of different water condition on MDA content of P.sylvestris var. mongolica in each treatment

在非干旱脅迫條件下，各處理POD活性無顯著差異(圖3)；在干旱脅迫條件下，各處理POD活性均顯著升高，未接種處理POD活性顯著低于各接種處理(P<0.05)。與非干旱脅迫相比，干旱脅迫條件下，R.l、S.l、S.b、S.s和T.f處理POD活性分別升高了67.1%、54.3%、75.8%、42.1%和40.3%；而未接種處理僅升高了22%，升高的幅度明顯低于接種處理。干旱脅迫能引起植物體內(nèi)活性氧升高，導(dǎo)致細(xì)胞膜受到損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能，而抗氧化酶活性(SOD與POD活性)的升高有利于清除體內(nèi)多余活性氧，從而降低植物機體的損傷程度，增強植物抗旱性；因此，說明菌根化樟子松幼苗的抗旱能力強于非菌根化苗木。

在非干旱脅迫條件下，接種處理MDA含量之間無顯著差異；但未接種處理MDA含量顯著高于各接種處理(圖4)。在干旱脅迫條件下，各處理MDA含量均顯著升高，且各接種處理MDA含量均顯著低于未接種處理(P<0.05)。因此，在干旱脅迫條件下，菌根的存在能抑制樟子松體內(nèi)丙二醛含量的積累。從而說明菌根的形成對植物逆境脅迫抗氧化產(chǎn)物的清除能力顯著提高。

經(jīng)雙因素方差分析，接種處理與水分處理分別對樟子松幼苗POD活性、SOD活性與MDA含量產(chǎn)生極顯著影響(P<0.001)；而接種和水分的相互作用只對幼苗POD活性產(chǎn)生極顯著影響(P<0.001)；卻不會影響幼苗SOD活性與MDA含量(表5)。

2.4 不同處理對樟子松幼苗萎蔫時間和臨界致死時間的影響

在干旱脅迫下，與對照相比，所有接種處理的樟子松萎蔫時間和臨界致死時間均顯著推遲(P<0.05)，推遲時間最長的均為S.b處理，分別推遲了96.3和113.8 h；推遲時間最短的均為T.f處理，也分別推遲了13.1和52 h。所以，菌根化苗木均能促使宿主忍耐干旱而延長萎蔫和死亡的時間。因此，在自然環(huán)境中，形成菌根能夠使植物抵御一定時期的季節(jié)性干旱(表6)。

表5 接種處理與水分處理對樟子松抗氧化酶活性的雙因素方差分析結(jié)果

Table 5 The results of two-way ANOVA of antioxidant enzyme activities ofP.sylvestrisvar.mongolicaby inoculation treatment and water treatment

處理Treatment超氧化物歧化酶SOD過氧化物酶POD丙二醛MDA接種處理Inoculation treatment(IT)?????????水分處理Water treatment(WT)?????????接種處理×水分處理IT×WTNS???NS

注：***.P<0.001差異極顯著；NS.不顯著

Note:***.P<0.001 is extremely significant; NS.Not significant

表6 干旱脅迫條件下不同處理對樟子松幼苗萎蔫時間和臨界致死時間的影響

Table 6 Effect of different treatments on wilting time and critical dead time ofP.sylvestrisvar.mongolicaunder the condition of drought stress(h)

指標(biāo)Index菌種StrainS.bR.lS.lS.sT.fCK萎蔫時間Wilting time510.6±8.97a438.5±11.77b451.6±15.21b444.2±13.58b427.4±14.38c414.3±9.04d臨界致死時間Critical lethal time565.4±11.11a512.6±10.72b544.1±8.66ab514.8±12.70b503.6±12.33bc451.6 ±14.65d

注：同一行不同字母表示P<0.05差異顯著。

Note:Different letters in the same line indicate significant difference inP<0.05.

3 討論

干旱脅迫是限制植物生長與生存的一個重要因素[11]，不同植物對干旱脅迫的響應(yīng)不同。在非生物脅迫條件下，菌根共生效應(yīng)是評估宿主植物生長狀況的重要指標(biāo)[12]。本研究中，菌根化樟子松幼苗的各項生長指標(biāo)均顯著高于對照，說明ECMF在不同程度上促進了樟子松苗木的生長，這可能是因為ECMF能夠促進苗木對養(yǎng)分和水分的吸收[13]。這與Rui等[14]和Zhang等[15]對其他菌樹組合的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，S.b處理的菌根侵染率最高，同時，其苗高和地下生物量均顯著高于對照。因此，在一定程度上，菌根侵染率對苗木苗高和地下生物量具有積極的作用，這與Yin等[16]的研究結(jié)果相符。通過雙因素方差分析得知，接種處理對樟子松幼苗地上生物量與地下生物量均產(chǎn)生極顯著作用(P<0.001)；而水分處理對其地下生物量產(chǎn)生顯著作用(P<0.05)，但對地上生物量影響不顯著。這可能是因為在干旱脅迫下，菌根的存在有利于植物根系對水分吸收，從而增加地下生物量的積累，來增強植物的抗旱能力[17]。根莖比是評價苗木質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，根莖比越大苗木對環(huán)境的適應(yīng)力越強[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下各接種處理的根莖比均顯著高于未接種處理，Moser等[5]對樟子松幼苗的抗旱性研究也得出了這一結(jié)論，這可能是由于干旱脅迫下ECMF能誘導(dǎo)碳水化合物更多的流向植物根系，有助于植物根系對水分和養(yǎng)分的吸收，從而提高苗木養(yǎng)分狀況和水分利用效率[19]。此外，在干旱脅迫下，各處理之間存在差異，這可能是因為不同菌種具有不同的養(yǎng)分吸收能力，也就是說不同菌種對干旱脅迫的耐受力不同[20]。

在植物遭受干旱脅迫時，其體內(nèi)活性氧將顯著增多，而活性氧的累積會直接引發(fā)或者加劇植物細(xì)胞膜的氧化損傷[21]。在這種情況下，植物將產(chǎn)生一套保護系統(tǒng)來清除多余的活性氧，以減輕對細(xì)胞膜的傷害，這套保護系統(tǒng)主要由酶促清除系統(tǒng)組成[22]。在本研究中，干旱脅迫下接種處理的SOD和POD活性均顯著高于未接種處理；同時，各處理的這兩種酶活性較非干旱脅迫條件下均顯著提高。張中峰等[23]對接種彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)的青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)幼苗的研究也得出了一致的結(jié)果。MDA含量是植物細(xì)胞膜過氧化程度的體現(xiàn)，MDA含量越高，說明植物細(xì)胞膜過氧化程度高，受到的傷害越嚴(yán)重[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下接種處理苗木的MDA含量顯著低于未接種處理，說明苗木形成菌根后能抑制MDA的積累，且未接種處理細(xì)胞膜的損傷程度大于菌根化苗木，進而說明非菌根化苗木對干旱脅迫的耐受力較弱，這與Yin等[16]和李靜[25]的研究結(jié)果一致。通過以上結(jié)果我們可以推測，ECMF共生體在干旱脅迫生境中增強了植物中SOD和POD活性，同時抑制了MDA含量的積累，從而增強了菌根化樟子松苗木的抗旱性。本研究結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，所有接種處理的樟子松苗木的萎蔫時間和臨界致死時間均較未接種處理顯著推遲。王琚鋼等[26]對菌根化蒙古扁桃(Prunusmongolica)抗旱性的研究也發(fā)現(xiàn)，與CK相比，菌根苗葉片發(fā)生萎蔫的時間顯著推遲。同時研究證實：S.b處理的這些指標(biāo)都顯著高于其他接種處理。因此，接種粘蓋牛肝菌(S.b)的樟子松抗旱性最強，可以認(rèn)為是一個較為理想的抗旱菌樹組合。