miR-122在糖尿病合并慢性乙型肝炎患者中的表達及臨床意義研究*

朱杰華，王江林，豐智雪，陳安林，黃 健，杜文勝△

1.遵義醫科大學附屬醫院醫學檢驗科，貴州遵義 563000；2.貴州省仁懷市中醫院檢驗科，貴州仁懷 564500；3.遵義醫科大學醫學與科技學院，貴州遵義 563099

乙型肝炎是目前最常見的慢性傳染病，有著相當高的發病率和病死率。據世界衛生組織報道，我國慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者約9 300萬，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬，每年約有100萬人死于HBV導致的肝衰竭、肝硬化及肝癌。糖尿病(DM)是最常見的慢性代謝性疾病，目前全世界的DM患者已達2.46 億[1]，而由DM引起的心腦血管、視網膜、腎臟、神經損傷等可加重患者的病情，嚴重影響患者的治療和預后[2-4]。微小RNA-122(miR-122)是微小RNA(microRNA)家族的一員，參與機體的新陳代謝，免疫功能，細胞增殖、凋亡，組織生長及分化等過程[5]。研究認為DM可以通過影響肝臟對脂肪的代謝，間接影響肝細胞內miR-122的表達，進而影響肝細胞的生物學功能[6]。在肝細胞中，miR-122不僅對肝細胞的生長周期、脂肪代謝等肝臟生理功能具有重要調節作用，而且與病毒性肝炎關系密切[7]。此外，臨床發現DM會增加HBV感染的風險，但miR-122在DM合并HBV感染中的具體作用和可能機制目前尚不明確。本文通過對DM患者、慢性乙型肝炎患者、DM合并慢性乙型肝炎患者外周血標本miR-122水平的分析，探討了miR-122在不同患者中的差異性表達情況及其與臨床生化指標間的關系，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月到2017年8月于遵義醫科大學附屬醫院內分泌科和感染科住院治療的患者125例為研究對象，其中臨床明確診斷的DM患者(DM組)50例，男27例、女23例，年齡11～78歲、平均(34.5±10.40)歲；慢性乙型肝炎患者(HBV組)50例，其中男30例、女20例，年齡14～58歲、平均(31.58±10.03)歲；DM合并慢性乙型肝炎患者(DM合并HBV組)25例，其中男11例、女14例，年齡17～73歲、平均(34.58±11.31)歲。隨機挑選同期于該院健康體檢者20例為對照組，其中男14例、女6例，年齡21～38歲、平均(28±8.5)歲。納入標準：DM組患者均符合DM診斷標準；HBV組患者均符合慢性乙型肝炎診斷標準；DM合并HBV組患者均同時符合DM及慢性乙型肝炎診斷標準。排除標準：合并其他慢性代謝性疾病、脂肪肝、藥物性肝炎、自身免疫性疾病、感染性疾病和遺傳性疾病的患者；合并嚴重心腦腎等重要臟器功能障礙的患者；合并精神障礙的患者。4組研究對象性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2儀器與試劑 奧林巴斯AU5400全自動生化儀、雅培i2000化學發光檢測儀、全自動糖化血紅蛋白檢測儀、實時熒光定量PCR儀、生物安全柜、低溫高速離心機等。試劑包括RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒等。

1.3方法

1.3.1總RNA提取 采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次收集沉淀；RNA的提取嚴格按試劑盒說明書進行，取3 μL RNA用1.2%瓊脂凝膠電泳檢測，余RNA于-20 ℃保存待用。

1.3.2反轉錄 按試劑盒說明書進行反轉錄體系配制，2×反轉錄緩沖液10 μL，反轉錄引物1.2 μL，RNA 2 μL，MMLV反轉錄酶0.2 μL，加入DEPC至總體系體積為20 μL，反應條件為42 ℃ 15 min，85 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。

1.3.3實時熒光定量檢測 以U6作為內參基因，采用實時熒光定量PCR技術檢測miR-122的表達水平，其反應體系為2×定量PCR Master Mix 10 μL，上游引物0.08 μL，下游引物0.08 μL，cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，ddH2O加至20 μL。反應條件為95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 min，40個循環。miR-122的表達水平計算：用2-ΔΔCt代表miR-122的表達水平，其中Ct值是指從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數。

1.3.4生化指標檢測 所有研究對象抽取空腹靜脈全血3 mL，靜置30 min后,3 000 r/min離心10 min,分離血清，待測。采用草酰乙酸脫氫酶法檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平；采用己糖激酶法檢測血糖(GLU)水平；采用實時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA水平。

1.4觀察指標 比較各組miR-122的表達水平；比較各組生化指標(ALT、AST、GLU)及HBV-DNA水平；進一步行相關性分析明確各組miR-122表達水平與ALT、AST、GLU、HBV-DNA水平的相關性。

2 結 果

2.1各組miR-122表達水平比較 以U6作為內參，分析各組的miR-122表達水平，結果顯示：對照組miR-122表達水平低于HBV組、DM 組和DM合并HBV組，差異均有統計學意義(P<0.05)；DM合并HBV組miR-122表達水平高于HBV組、DM組和對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-122表達水平比較

注：與對照組比較，#P<0.05；與DM合并HBV組比較，*P<0.05。

2.2各組生化指標水平比較 HBV組HBV-DNA水平高于DM合并HBV組，差異有統計學意義(P<0.05)；DM組和DM合并HBV組GLU水平高于對照組和HBV組，差異有統計學意義(P<0.05)；HBV組ALT和AST水平高于對照組、DM組和DM合并HBV組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組生化指標水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與HBV組比較，△P<0.05；與DM組比較，#P<0.05。

2.3各組miR-122水平與ALT、AST、GLU、HBV-DNA水平的相關性分析 對照組miR-122水平與GLU、AST、ALT、HBV-DNA水平均無顯著相關性(P>0.05)；HBV組miR-122水平與AST、ALT水平呈正相關(r=0.287、0.292，P<0.05)；DM組miR-122水平與GLU水平呈正相關(r=0.350，P<0.05)；DM合并HBV組miR-122水平與HBV-DNA、GLU水平呈正相關(r=0.238、0.231，P<0.05)。

3 討 論

DM是最常見的代謝性疾病之一，其發病受多種因素的影響，有研究認為microRNA可能參與了DM的發病，同時還與DM相關并發癥有關。鄧仁生等[8]發現DM患者miR-126、miR-28-3p水平顯著升高，并可能通過參與調控胰島素及其受體信號通路和血管生成等導致DM的發生。周燕等[9]則發現2型DM患者中miR-217水平升高，并與沉默調節因子和缺氧誘導因子存在相關性，可促進DM腎損害的發展。另外，也有研究發現miR-29可通過調節靶基因PKR結合蛋白X的表達，參與DM視網膜病變的發生[10]。miR-135b可通過調控Smad5基因促進系膜細胞增殖及腎臟纖維化[11]。由此可見，microRNA在DM的發生、發展過程中發揮著重要作用。既往關于miR-122與DM的相關性研究發現，miR-122與血脂水平具有相關性，其可通過下調膽固醇7-羥化酶α的基因表達，抑制膽固醇向膽汁酸轉化，最終使血漿膽固醇水平升高[12]，此外，阻斷miR-122表達可下調幾種與三酰甘油合成相關基因的表達，從而減少肝臟三酰甘油的合成，降低血漿中三酰甘油水平[13]。

在肝臟中,miR-122與肝細胞的生長周期、脂肪代謝等生理過程有關，同時還參與病毒性肝炎的發病[7]。一方面，HBV可以利用宿主細胞內的microRNA來改變宿主細胞環境，使其有利于自身存活；另一方面，HBV可以編碼microRNA來協助自身的生存和增殖。有研究發現，miR-122在HBV感染者中表達水平升高，并參與肝纖維化的發生[14]。而體外細胞實驗發現miR-122的過量表達可抑制HBV的復制[15]。然而，有研究也發現，雖然慢性HBV感染引起肝臟損傷時會檢測到miR-122水平的升高，但血漿中miR-122水平與HBeAg、HBV-DNA 水平均無明顯相關性[16]。臨床工作發現DM患者HBV的感染風險升高[17-18]，同時，DM還會引起脂肪代謝異常，導致肝細胞脂質沉積、脂肪病變，進一步加重肝損傷[19]。SCHILLIE等[17]的研究結果表明，DM患者的HBV感染率是非DM人群的1.6倍；REILLY等[18]調查發現，11.0%的急性HBV感染患者同時患有DM。miR-122既與HBV感染有關又參與DM發病，但其在DM合并慢性HBV感染中的作用及其在臨床診斷、治療中的意義目前尚不明確。

為了進一步探討miR-122在DM合并慢性HBV感染中的作用及臨床價值，本研究對DM患者、慢性乙型肝炎患者、DM合并慢性乙型肝炎患者外周血標本中miR-122的表達水平進行分析發現，miR-122在HBV組、DM組、DM合并HBV組的表達水平均高于對照組。且DM合并HBV組的miR-122水平顯著高于HBV組和DM組。提示DM患者存在miR-122的水平升高，當合并HBV感染時，其miR-122水平升高更為顯著。進一步對DM合并HBV組中miR-122水平與生化指標進行相關性分析發現，DM合并HBV組患者的miR-122水平與GLU、HBV-DNA水平呈正相關，推測miR-122可能參與了DM合并慢性乙型肝炎患者疾病的發生與發展過程。此外，4組間生化指標比較發現，HBV組HBV-DNA水平顯著高于DM合并HBV組，考慮與miR-122在DM合并慢性乙型肝炎患者中過量表達對HBV具有負向調控作用相關[15]。但相關性分析發現，HBV組的HBV-DNA水平與miR-122水平無明顯相關性，考慮可能與納入的病例數較少，數據存在偏倚有關。

綜上所述，miR-122的表達水平在DM合并慢性乙型肝炎患者中明顯升高，其可能參與了疾病的發生、發展過程，但具體的分子機制目前尚不明確，有待進一步研究。