CNAS-GL039驗證HCV-RNA定量檢測系統*

黃 靜，李俊如，張 帥

四川省西昌市涼山彝族自治州第一人民醫院檢驗科，四川西昌 615000

丙型肝炎病毒(HCV)的全球感染率達3%，其感染后引起的丙型病毒性肝炎為常見的感染性疾病，控制不佳還可發展為肝衰竭，嚴重影響患者健康。HCV感染1周內人體內就可檢測出HCV-RNA，應用分子生物學技術定性檢測HCV-RNA可用于HCV感染的早期診斷,解決了免疫學檢測的“窗口期”問題。此外，定量檢測HCV-RNA的拷貝數，對動態監測HCV的傳染性、病毒復制情況、抗病毒藥物療效及判斷患者預后等有著重要的臨床意義[1]。因此，HCV-RNA檢測結果的準確性顯得尤為重要。臨床PCR實驗操作煩瑣，影響檢測結果的因素較多，為評估檢測系統性能，保證檢測結果準確，進一步完善實驗室質量控制體系，本研究參照中國合格評定國家認可委員會(CNAS)-GL039[2]對HCV-RNA定量檢測系統的準確度、精密度(重復性和中間精密度)和線性區間進行了分析驗證，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機收集HCV感染者HCV-RNA水平為107、102IU/mL的血清標本(無溶血、脂血、黃疸)各15 mL，充分混勻后各取300 μL分裝至滅菌EP管內，置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2儀器與試劑 湖南圣湘生物科技有限公司生產的稀釋用小牛血清；原衛生部臨床檢驗中心第二次室間質評標本：1721、1722、1723、1724、1725；北京康徹思坦公司提供的HCV-RNA標準物質：103、104IU/mL的血清標本(批號：201708003、201706001)；核酸提取儀 (湖南圣湘，型號：S11A)；ABI公司生產的實時熒光定量PCR擴增儀(ABI75000，批號：275051447)；丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)(湖南圣湘,批號：2017031)。

1.3方法

1.3.2線性驗證 將HCV-RNA水平為107IU/mL的血清標本作為初始標本，用小牛血清依次以10倍水平梯度稀釋至106、105、104、103、102IU/mL，稀釋當天每份標本檢測2次，計算每一水平實測值(為測量均值)，排除離群值。以稀釋倍數為橫軸,每個稀釋倍數所對應的實測值為縱軸進行線性回歸分析,求出回歸方程Y=aX+b和相關系數的平方(R2)，如果R2>0.95，則可以初步判斷廠家提供的線性范圍符合要求。根據線性回歸方程求出每一稀釋倍數符合線性方程的理論值，計算每一稀釋倍數實測值和理論值間的差異[4]，實測值與理論值均用對數形式表示。以能力驗證/室間質評評價界限(靶值±2/5對數值)作為TEa[5]。

1.3.3準確度驗證 檢測室間質評標本1721、1722、1723、1724、1725，并將實測值與CANS認可的原衛生部臨床檢驗中心提供的PT項目結果(HCV-RNA)進行對比，使用PT項目時應不少于5份[3]。以能力驗證/室間質評評價界限(靶值±2/5對數值)作為TEa[5]。實測值與靶值均用對數形式表示。

1.4統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，建立線性回歸方程判斷線性范圍是否符合要求。

2 結 果

2.1精密度驗證 HCV-RNA 107、102IU/mL兩水平標本的實驗室內s分別為0.047 9、0.033 5，滿足重復性<3/5TEa(0.24)的要求，見表1。HCV-RNA 103、104IU/mL兩水平室內質控品2018年1-6月的s分別為0.09、0.09，滿足中間精密度<4/5TEa(0.32)的要求，見表2。

表1 HCV-RNA重復性驗證結果

2.2線性驗證 線性回歸方程為Y=-0.995 7X+ 8.376 7，R2=0.999 6，初步判斷線性范圍符合要求。每一稀釋倍數實測值和理論值的差異均滿足TEa要求，見表3。

表2 HCV-RNA中間精密度驗證結果

表3 HCV-RNA線性驗證結果

2.3準確度驗證 將實測值與PT項目(HCV-RNA)結果進行對比，均滿足TEa要求，見表4。

表4 準確度驗證結果

3 討 論

實時熒光定量PCR檢測技術以其高靈敏度、高特異度、全封閉單管擴增等優勢逐漸在各臨床實驗室中被廣泛使用。目前尚無權威機構發布分子診斷相關的檢驗程序性能驗證的具體解釋和指導意見，為保證檢測結果的準確、可靠，有大量文獻進行了自建性能驗證方法探討[6-9]。2019年2月15日CNAS首次發布CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[2]，本實驗室依據CNAS-GL039標準對HCV-RNA定量檢測系統的性能進行了分析驗證。

線性是反映實驗室方法性能的重要指標之一，可反映分析物水平或活性與分析檢測系統之間相應的比例關系，在臨床醫生認為有價值的分析檢測范圍內實驗方法呈線性，了解分析結果與真值之間的偏差，才能保證檢測結果準確可靠。本研究HCV-RNA稀釋倍數與實測值的線性回歸方程為Y=-0.995 7X+8.376 7，R2>0.95，每一稀釋倍數對應的實測值和計算理論值的差異均滿足TEa要求，可以初步判斷廠家提供的線性范圍符合要求，滿足臨床需要。

基因擴增檢測已被廣泛應用于臨床、科研工作，基因擴增檢測受基質效應、基因變異等多種因素影響，各試劑廠家實驗方法不同，因此檢測靈敏度、特異度差異較大。分子診斷中很多實驗缺乏參考方法，難于校準，因此實驗室將室間質評作為室內質控的有效補充，目前是分子診斷質量保證中不可或缺的部分。本研究將此次驗證檢測的室間質評標本的結果與原衛生部臨床檢驗中心的PT項目(HCV-RAN)結果對比，準確度滿足能力驗證要求。

綜上所述，CNAS-GL039為分子實驗室完善質量控制體系提供了切實可行的依據。根據CNAS-GL039對實驗室HCV-RNA定量檢測系統進行性能驗證結果顯示，該檢測系統在一定范圍內進行HCV-RNA檢測的結果準確、重復性好，適用于臨床實驗室。