鬼燈擎中巖白菜素超聲提取純化工藝的優化

雷燕妮,張小斌,李多偉，甘全明

(1.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院,陜西 商洛 726000；2.商洛學院 健康管理學院,陜西 商洛 726000；3.西北大學 生命科學與醫學部，陜西 西安 710069;4.陜西富士金醫藥保健品有限責任公司，陜西 西安 710075)

鬼燈檠又名七葉鬼燈檠，別名老蛇盤、秤桿七等，其是一種草本植物，屬虎耳草科，本品在我國秦巴山區廣泛分布，為民間常用草藥，其根莖是更為常用的藥材部分，主要功效為清熱解毒，除此之外還能止瀉、止血等。對菌痢、子宮脫垂、老年慢性支氣管炎等疾病都有較好的療效[1～3]。最近幾年，對其的研究更進一步，普遍發現其含有的巖白菜素(Bergenin)是關鍵成分，這也是其能夠發揮抑菌和抗病毒的主要原因，而且在鬼燈檠中含量較高。筆者通過單因素實驗和正交實驗，篩選出一個更加優化、甚至最優的最優工藝條件來超聲提取鬼燈檠中巖白菜素,同時通過實驗為其的提取純化的工業化生產提供科學的實驗數據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

鬼燈擎，巖白菜素(批號1532-200202)分別為陜西略陽縣華瑞杜仲開發有限責任公司和中國藥品生物制品檢定所所生產，其中前者通過了西北大學生命科學與醫學部李智選研究員鑒定。甲醇等化學試劑均為國產分析純，水為重蒸水。

1.2 實驗儀器

U3000高效液相色譜儀；ME235S-電子分析天平；RE-2000 A旋轉蒸發器；H·H·S21-6C電熱恒溫水浴鍋；101A-2型鼓風干燥箱；SB-4200DT超聲清洗器；SHB-C循環水式多用真空泵；LD5-10高速離心機；FZ102植物粉碎機。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 高效液相色譜法測定巖白菜素的含量[4、5]色譜條件 色譜柱: Kromasil-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:甲醇-水(25∶75)，檢測波長:275 nm，流速:1.0 mL·min-1，柱溫:(30±1)。

標準溶液的配制:取巖白菜素對照品，通過電子分析平精準稱取10.0 mg樣品，選取規格為50 mL容量瓶，向其中加入稱好的樣品，然后向容量瓶內倒入適量的甲醇，使兩者混合，溶解，最終充分均勻溶液得濃度為0.20 mg·mL-1對照品溶液。

標準曲線的繪制:對制作好的對照品溶液進行吸取，吸取量依次為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL，然后注入高效液相色譜儀中，按照上述的色譜條件的標準，準確計算并記錄高效液相色譜圖和峰面積。結果表明巖白菜素其進樣量(X,μg)與峰面積(Y)之間存在線性關系，線性范圍0.1～5.0 μg。

2.1.2 鬼燈擎中巖白菜素提取溶劑及提取方法的比較 取鬼燈擎粉末，精確稱取4份，各10.00 g，按1∶15料液比分別加入95%乙醇、75%乙醇、55%乙醇和水4種不同濃度的乙醇溶劑，浸泡1.0 h，然后在85℃水浴中熱回流提取2.0 h或超聲(20 kHz)提取1.0 h，過濾，用相應濃度的乙醇溶劑將濾液定容至250 mL，最后對白菜素的濃度進行檢測，采取方式是高效液相色譜法，計算含量。

2.1.3 鬼燈擎中巖白菜素提取率各單因素的影響 取鬼燈擎粉末準確稱取10.00 g，選取規格為250 mL的燒瓶，將稱取的粉末倒入其中，然后將95%乙醇混與其中，在不同的提取時間、不同的料液比、不同的提取次數、不同的提取溫度下進行超聲提取，過濾，濾液定容至250mL，用高效液相色譜法測定溶液中巖白菜素的濃度，計算含量。確定在不同提取條件下提取因素的變化范圍，以及各因素的最佳參數。

2.1.4 乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響 取鬼燈擎粉末，精確稱取100.00 g，3份，分別按1∶10料液比浸泡于95%乙醇、75%乙醇和55%乙醇3種不同濃度的乙醇溶劑中1.0 h，然后超聲(20 kHz)提取，其時間為45 min，總共提取兩次，然后對其進行過濾操作，獲得濾液后進行減壓濃縮使其沒有醇味，放涼，用稀酸堿調pH，析晶，離心得析晶物，烘干測定得率，最后檢測其中的巖白菜素的含量。

2.1.5 鬼燈擎中巖白菜素提取率的正交試驗 由上述單因素實驗可知鬼燈擎中巖白菜素醇超聲提取法優于醇熱回流提取法，參考乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響實驗結果，故確定鬼燈擎中巖白菜素采用95%乙醇超聲提取法。采用L9(34)設計正交試驗，研究超聲提取時間、料液比、超聲提取次數和超聲提取溫度對巖白菜素提取的影響，尋找最佳提取參數。

2.2 結果與分析

2.2.1 提取溶劑及提取方法的比較 巖白菜素的濃度的檢測，計算含量所得結果見表1。表1顯示，在熱回流法中，對鬼燈擎中巖白菜素的提取能力為95%乙醇>75%乙醇>55%乙醇>水；在超聲法中，對鬼燈擎中巖白菜素提取能力為95%乙醇>75%乙醇>55%乙醇>水；超聲法提取能力高于熱回流法；尤其是用75%、95%乙醇提取效果最佳，故本實驗確定采用75%、95%乙醇超聲提取法進行鬼燈擎中巖白菜素的提取。

2.2.2 鬼燈擎中巖白菜素提取率各單因素的影響 鬼燈擎中巖白菜素提取率各單因素的影響見表2。

表1 鬼燈擎中巖白菜素不同溶劑濃度不同提取方法提取效果的比較

表2 各單因素對鬼燈擎中巖白菜素提取率的影響

表2表明，巖白菜素醇超聲提取率隨醇超聲提取時間的延長而增加，45 min后巖白菜素超聲提取率增加緩慢，同時生產成本也會隨著時間的增加而增加，故超聲提取時間應控制在45～60 min為宜；巖白菜素醇超聲提取率隨醇超聲提取料液比的增加而增高，超過1∶10料液比后，巖白菜素醇超聲提取率隨超聲提取料液比的增加幅度變小。超聲提取料液比的增加會大大增加溶劑用量，造成生產成本的增加，故超聲提取料液比確定在1∶10為宜；巖白菜素醇超聲提取率提取2、3、4次的效果都好，但提取2次的效果與提取3次、4次的提取率效果增加不明顯，超聲提取次數增加會延長生產周期及溶劑的用量，會大大增加生產成本，故超聲提取次數確定在2次為宜；巖白菜素醇超聲提取率隨超聲提取溫度的增加提取率增加緩慢，在55℃后超聲提取率幾乎明顯變化，提取溫度的增加會增加生產成本，也會降低超聲提取設備的壽命，故超聲提取溫度以控制在45～55℃為宜。

2.2.3 乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響 表3顯示95%乙醇提取液含量與75%乙醇提取液含量相差不大，析晶物含量相差也不大，但析晶物得率相差很大，前者的轉化率高出后者的42.49%，說明在鬼燈擎巖白菜素提取純化中乙醇濃度是影響析晶物得率的關鍵，故在醇超聲提取中應該采用95%乙醇進行巖白菜素的提取純化，而不能采用75%乙醇或以下濃度的乙醇進行巖白菜素的提取純化。

2.2.4 鬼燈擎中巖白菜素提取率的正交試驗 用同樣的方法檢測巖白菜素的濃度，計算含量，鬼燈擎中巖白菜素提取率正交試驗結果見表4，直觀分析和方差分析的結果分別于表5和表6。

表3 乙醇濃度在鬼燈擎中巖白菜素提取純化中的影響

從直觀分析表5看出，A因素極差最大，B因素, D因素, C因素次之，表明對鬼燈擎中巖白菜素提取率影響最大的為A因素，其次為B因素、D因素、C因素。從方差分析表6看出，A因素F>F0.01，具有顯著意義，B因素F0.05>F>F0.1，有較顯著意義, C因素和D因素F0.1> F，無顯著性意義。根據各因素k的變化率得出：A因素選2水平, B因素選2水平, C因素選3水平, D因素選3水平,即鬼燈擎中巖白菜素醇超聲醇提的條件為A2B2C3D3。

表4 正交表L9(34)及結果

表5 鬼燈擎中巖白菜素提取率直觀分析結果

表6 鬼燈擎中巖白菜素提取率方差分析結果

3 討論

通過單因素試驗、純化實驗及正交試驗對鬼燈擎中巖白菜素醇超聲提取工藝進行優化實驗比較,綜合各實驗結果，確定鬼燈擎中巖白菜素醇超聲提取最佳工藝參數為選擇在45℃實驗溫度下，以1∶10料液比的比例，在45 min之內，用95%的乙醇對其進行超聲提取1到2次。因此醇超聲提取法更加具有優勢，尤其是在時間、溶劑方面，并且其操作的方式也更加方便。

超聲提取在科技人員的努力下，1～20 t·d-1投料規模的超聲提取工業化生產設備已在生產中推廣使用，因此，不斷完善超聲提取工藝是非常重要的。筆者實驗的研究結果經過了科學的論證，有著可靠地的根據促進鬼燈擎的產業化開發利用，可供工業規模化生產借鑒。